The efficiency of use lentiviral vectors for the transformation of rooster spermatogenic cells in vivo

Cover Page

Abstract


Male gonad cells are considered as promising target cells for the introduction of recombinant DNA within obtaining genetically modified individuals with given characteristics. The use of testicular spermatogonial stem cells is of the greatest interest. In the process of differentiation, this type of cell gives rise to a significant population of mature male germ cells. In the case of their genetic transformation, differentiated cells can be used to inseminate females in order to produce transgenic progeny. The aim of the research was to study the efficiency of using lentiviral vectors for the local transformation of roosters’ testicular spermatogenic cells. We used a lentiviral vector containing the ZsGreen reporter gene under the control of the CMV promoter. In vitro transformation of rooster spermatogenic cells was carried out by infection with a viral preparation, in vivo through multiple injections of the viral preparation into the testicular parenchyma of roosters ( n = 5). The efficiency of transformation was assessed by expression of the reporter ZsGreen gene in transfected spermatogenic cells. The success of using lentiviral vectors for the genetic transformation of rooster spermatogenic cells was shown in experiments in vitro and in vivo . The transformation efficiency of this cells types in an in vitro culture varied from 45 to 57% and averaged 48 ± 4%. The expression of the ZsGreen reporter gene in the cells of the spermatogenic epithelium of the testes was established in almost all experimental roosters in the in vivo experiments. The number of seminiferous tubules with transformed spermatogenic cells varied in the studied experimental roosters from 10 to 22%. The effectiveness of genetic transformation of the testes spermatogenic cells was 1.8 ± 0.2%. The obtained results indicate to the success of using lentiviral vectors for the genetic transformation of spermatogenic cells of rooster testes in vivo in order to create individuals with genetically transformed germ cells for the further production of transgenic offspring with given characteristics.


Введение Применение половых клеток самцов рассматривается как один из способов получения сельскохозяйственных животных с измененным геномом, в т.ч. птицы [1, 2]. При этом в качестве клеток-мишеней для введения рекомбинантной ДНК могут использоваться как зрелые мужские половые клетки - спермии, так и их предшественники на более ранних сроках дифференцировки - сперматогонии, сперматоциты и сперматиды [3-5]. С точки зрения эффективности трансгенеза из всей популяции клеток сперматогенного эпителия главный интерес представляет генетическая модификация сперматогонии. Данный тип клеток относят к стволовым клеткам семенников [6]. В процессе дифференцировки они дают начало значительной популяции зрелых мужских половых клеток [7]. Исходя из этого генетическая трансформация половых клеток самцов на стадии сперматогоний позволяет повысить эффективность трансгенеза по сравнению с проведением генно-инженерных манипуляций с другими типами сперматогенных клеток, в т.ч. спермиями. Генетическая трансформация сперматогоний возможна с использованием двух методических подходов: 1) трансфекцией культуры данных клеток in vitro с дальнейшим их введением в семенники самцов-реципиентов, подвергшихся химической стерилизации, и 2) трансформацией клеток сперматогенного ряда in vivo путем инъекционной обработки генной конструкцией непосредственно в семенники взрослых особей [8-11]. С точки зрения материальных и временных затрат наиболее предпочтительным является второй подход, так как манипуляции проводятся на взрослых самцах, что сокращает сроки получения трансгенных особей. Генетическая трансформация сперматогенных клеток, в том числе сперматогоний, in vivo возможна с использованием векторов, основанных на ретро- и лентивирусах. Метод базируется на их природной способности переносить рекомбинантную ДНК в соматические клетки. Таким образом, применение генных конструкций, которые получены на основе этих вирусов, позволяет осуществлять трансформацию отдельных органов и тканей уже во взрослых особях. Ранее нами была показана возможность использования ретровирусных векторов для локальной трансформации клеток семенников петухов и хряков [12]. Мы изучили эффективность использования лентивирусных векторов для генетической трансформации сперматогоний петухов in vivo. Материалы и методы В работе использовали лентивирусный вектор, содержащий репортерный ген ZsGreen под контролем CMV промотора. Источником генной конструкций был выбран вирусный препарат. Трансформацию культуры клеток сперматогоний петуха in vitro выполняли с помощью инфицирования препаратом, содержащим рекомбинантный лентивирус. Эффективность заражения клеток определяли как отношение количества полученных генетически трансформированных клеток к общему числу клеток, подвергшихся инфицированию. Внесение генных конструкций в паренхиму семенников петухов (n = 5) in vivo проводили путем множественных инъекций вирусного препарата (5-8 инъекций на семенник). По достижении половозрелости от опытных самцов отбирали пробы тканей семенников для анализа экспрессии рекомбинантного белка с использованием флуоресцентной микроскопии. Гистологические срезы толщиной 5 мкм готовили на криостате. От каждого самца проанализировали не менее 15 гистологических срезов. Результаты и обсуждение Для оценки возможности использования генных конструкций на основе лентивирусного вектора вначале был проведен ряд исследований по трансформации клеток сперматогоний петухов in vitro в культуре. Использование лентивирусного препарата в проведенных экспериментах показало эффективность трансформации клеток-мишеней у петухов, а количество модифицированных клеток варьировало от 45 до 57% и составляло в среднем 48 ± 4%. Результаты, полученные в ходе in vitro исследований, послужили заделом для проведения дальнейших опытов по переносу рекомбинантной ДНК in vivo в сперматогенные клетки петухов. Ранее в наших исследованиях было изучено, что оптимальным периодом для проведения биоинженерных манипуляций с клетками сперматогенного эпителия у петухов является возраст от 1 до 8 недель [13]. В этот возрастной период популяция сперматогенных клеток в семенных канальцах преимущественно представлена сперматогониями и клетками Сертоли. Используя эту наработку, введение генной конструкции проводили в семенники петухов, подобранных по возрасту, который составил 2 месяца. По достижении половозрелости у опытных петухов была изучена экспрессия репортерного гена ZsGreen в клетках сперматогенного эпителия. Наличие трансформированных флуоресцирующих сперматогенных клеток в семенных канальцах семенников было установлено у всех опытных петухов. Количество семенных канальцев на одном срезе, в которых наблюдались трансформированные клетки, варьировало от 10 до 22% в зависимости от индивидуальных особенностей самцов, что составило в среднем 16 ± 2% (табл. 1). При этом в одном семенном канальце среднее число трансформированных клеток сперматогенного ряда составило 12 ± 1% при общей эффективности трансгенеза (отношение числа трансформированных сперматогенных клеток к их общему числу во всех исследованных семенных канальцах) 1,8 ± 0,2%. Таблица 1 Эффективность использования лентивирусного вектора для генетической трансформации клеток семенников петухов in vivo Показатель Инд. номер опытной птицы № 1 № 2 № 3 № 4 № 5 Исследовано срезов n 15 20 15 18 15 Эффективность трансформации семенных канальцев Количество срезов с трансформированными семенными канальцами n, % 10 (65) 15 (75) 11 (72) 9 (50) 7 (44) Доля трансформированных канальцев на срезе, % 10 15 22 17 16 Эффективность трансформации сперматогенных клеток Среднее количество сперматогенных клеток в одном семенном канальце: всего n 702 685 625 652 692 трансформированных* n 12 14 16 10 8 Число семенных канальцев на исследованных срезах n 221 210 185 196 204 Общее количество сперматогенных клеток: в трансформированных канальцах n 2 652 2 940 2 960 1 960 1 632 во всех исследованных канальцах n 155 142 143 850 115 625 127 792 141 168 Общая эффективность трансгенеза**, % 1,7 2,0 2,6 1,5 1,2 Примечание: * среднее число трансформированных клеток в одном семенном канальце - отношение числа трансформированных сперматогенных клеток к общему числу исследованных семенных канальцев; ** общая эффективность трансгенеза - отношение числа трансформированных сперматогенных клеток к их общему числу во всех исследованных канальцах. Table 1 Efficiency of using a lentiviral vector for genetic transformation of rooster testicular cells in vivo Indicator Experimental bird number № 1 № 2 № 3 № 4 № 5 Investigated slices, n 15 20 15 18 15 The effectiveness of the transformation of the seminiferous tubules The number of slices with transformed seminiferous tubules n, % 10 (65) 15 (75) 11 (72) 9 (50) 7(44) The proportion of transformed tubules at the slicee, % 10 15 22 17 16 The efficiency of transformation of spermatogenic cells The average number of spermatogenic cells in one seminiferous tubule: total n 702 685 625 652 692 transformed* n 12 14 16 10 8 The number of seminiferous tubules in the studied slices n 221 210 185 196 204 The total number of spermatogenic cells: in transformed tubules n 2 652 2 940 2 960 1 960 1 632 in all studied tubules n 155 142 143 850 115 625 127 792 141 168 The overall efficiency of transgenesis**, % 1.7 2.0 2.6 1.5 1.2 Note: *The average number of transformed cells in one seminiferous tubule is the ratio of the number of transformed spermatogenic cells to the total number of testicular tubules examined; **The total efficiency of transgenesis is the ratio of the number of transformed spermatogenic cells to their total number in all studied tubules. Таким образом, проведенные нами исследования показали возможность использования лентивирусных векторов для трансформации генома петухов в сперматогенных клетках семенников in vivo с целью создания особей с генетически трансформированными половыми клетками для дальнейшего получения трансгенного потомства с заданными признаками.

Natalya Alexandrovna Volkova

Federal Science Center for Animal Husbandry named after Academy Member L.K. Ernst

Author for correspondence.
Email: natavolkova@inbox.ru
Moscow region, Russian Federation

Doctor of Sciences in Biology, Professor of the Russian Academy of Sciences, Head of the Laboratory of Cell Engineering

Anastasia Nikolaevna Vetokh

Federal Science Center for Animal Husbandry named after Academy Member L.K. Ernst

Email: anastezuya@mail.ru
Moscow region, Russian Federation

Researcher of the Laboratory of Functional and Evolutionary Genomics of Animals

Lyudmila Aleksandrovna Volkova

Federal Science Center for Animal Husbandry named after Academy Member L.K. Ernst

Email: ludavolkova@inbox.ru
Moscow region, Russian Federation

Candidate of Sciences in Biology, Senior Researcher of the Laboratory of Cell Engineering

Anatolievna Zinovyeva Nataliya

Federal Science Center for Animal Husbandry named after Academy Member L.K. Ernst

Email: n_zinovieva@mail.ru
Moscow region, Russian Federation

Doctor of Sciences in Biology, Academician of the Russian Academy of Sciences

  • Brinster RL. Germline stem cell transplantation and transgenesis. Science. 2002; 296(5576): 2174—2176. Available from: doi: 10.1126/science.1071607.
  • Zheng Y, Zhang Y, Qu R, He Y, Tian X, Zeng W. Spermatogonial stem cells from domestic animals: Progress and prospects. Reproduction. 2014; 147(3):R65—R74. Available from: doi: 10.1530/REP-13-0466.
  • Spadafora C. Sperm cells and foreign DNA: a controversial relation. Bioassays. 1998; 20(11):955—964. Available from: doi: 10.1002/(SICI)1521-1878(199811)20:11<955::AID-BIES11>3.0.CO;2-8.
  • McLean DJ. Spermatogonial stem cell transplantation and testicular function. Cell Tissue Research. 2005; 322(1):21—31. Available from: doi: 10.1007/s00441-005-0009-z.
  • Brinster RL, Nagano M. Spermatogonial stem cell transplantation, cryopreservation and culture. Seminars in Cell & Developmental Biology. 1998; 9(4):401—409. Available from: doi: 10.1006/scdb.1998.0205.
  • De Rooij DE, Griswold MD. Questions about spermatogonia posed and answered since 2000. Journal of andrology. 2012; 33(6):1085—1095. Available from: doi: 10.2164/jandrol.112.016832.
  • Bykova VL, Zhunkeira LK, Karneiro Zh. (eds). Histology: atlas, study guide. Мoscow: GEOTAR Media Publ.; 2009. (In Russ).
  • Yu F, Ding LJ, Sun GB, Sun PX, He XH, Ni LG, Li BC. Transgenic sperm produced by electrotransfection and allogeneic transplantation of chicken fetal spermatogonial stem cells. Molecular Reproduction and Development: Incorporating Gamete Research. 2010; 77(4):340—347. Available from: doi: 10.1002/mrd.21147.
  • Oatley JM. Spermatogonial stem cell biology in the bull: development of isolation, culture, and transplantation methodologies and their potential impacts on cattle production. Reprod. Domest. Rumin. 2010; 67(7):133—143.
  • Savchenkova IP, Korzhikova SV, Kostereva NV, Ernst LK. Cultivation and transplantation of boar type A spermatogonia. Ontogenesis. 2006; 37(4):292—300. (In Russ).
  • Novgorodova IP, Mormyshev AN, Volkova NA, Zinovieva NA, Ernst LK. Genetic transformation of rabbit spermatogonium in vivo. Biotechnology. 2008; (1):24—28. (In Russ).
  • Volkova N.A., Zinovieva N.A., Volkova L.A., Lotsmanova N.S., Ernst L.K. Study of factors affected the efficiency of gene transfer into the male germ cells of agricultural animals. Agricultural Biology. 2010; 45(6):16—19. (In Russ).
  • Beloglazova EV, Kotova TO, Volkova NA, Volkova LA, Zinovieva NA, Ernst LK. Age dynamics of spermatogenesis in cocks in connection with optimization of bioengineering manipulation time. Agricultural Biology. 2011; 46(6):60—64. (In Russ).

Views

Abstract - 24

PDF (Russian) - 19

PlumX


Copyright (c) 2019 Volkova N.A., Vetokh A.N., Volkova L.A., Nataliya A.Z.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.