Совершенствование методов тестирования почвы на выявление спор возбудителя рака картофеля Synchytrium endobioticum с использованием молекулярных методов

Полный текст

Введение

Известно, что картофель является одной из самых поражаемых сельскохозяйственных культур, с ним связано 34 вида карантинных вредных организмов Единого перечня карантинных объектов ЕАЭС. К числу данных видов относится возбудитель рака картофеля гриб Synchytrium endobioticum (Schilb.) Percival., имеющий ограниченное распространение на территории РФ.

Несмотря на то, что данное заболевание известно с конца XIX в., оно является очень значимым и строго контролируется на государственном уровне во многих странах мира. Актуальность данного заболевания связана также с проблемой появления вирулентных патотипов гриба, что усложняет процесс ликвидации очагов с применением устойчивых к раку сортов картофеля. Впервые сведения о внутривидовой дифференциации у S. endobioticum появились в 1942 г., когда в Германии был обнаружен новый патотип с повышенной вирулентностью [1—4]. Для удобства проведения идентификации была разработана стандартизированная система числового кодирования патотипов [5, 6]. В 2009 г. вирулентный патотип, кодируемый номером 38 (Nevsehir), был идентифицирован в Турции [7].

Последний патотип 39 (Р1) был описан в Польше в 2015 г. [8].

Учитывая высокую вредоносность заболевания, длительный период жизнеспособности спор гриба в очаге и отсутствие эффективных мер борьбы, во многих странах мира действуют строгие карантинные фитосанитарные меры по контролю S. endobioticum [9]. В последние десятилетия данному заболеванию уделяется повышенное внимание в связи с выявлением большого количества вирулентных патотипов в различных странах, включая регион ЕОКЗР [7, 10—12].

В связи с ежегодным ввозом на территорию РФ семенного и продовольственного картофеля, а также другого посадочного материала, содержащего почву, сохраняется высокий фитосанитарный риск интродукции в страну S. endobioticum, в т.ч. новых вирулентных патотипов. В связи с этим большое значение имеет быстрое и достоверное определение зараженности почвы спорами S. endobioticum. С этой целью в российских лабораториях для выделения спор гриба традиционно используется метод флотации в черыреххлористом углероде с последующим микроскопированием всплывшей органики и морфометрией выявленных спор. Существенным недостатком данного метода является использование высокотоксичного реактива и трудоемкость микроскопирования. Кроме того, метод дает низкую достоверность при тестировании торфянистой почвы из-за большого количества всплывающей органики.

С учетом отмеченных выше недостатков была предпринята попытка использования молекулярного метода тестирования почвы на выявление S. endobioticum методом прямого выделения ДНК гриба из почвенных образцов с использованием набора реагентов «МетаГен/MetaGen» производства ООО «НПФ Синтол» (Москва) с последующим проведением ПЦР «в реальном времени».

Цель исследования — совершенствование лабораторной диагностики на выявление возбудителя рака картофеля S. endobioticum из почвенных образцов с использованием метода прямого выделения ДНК патогена с последующей идентификацией ПЦР «в реальном времени».

Материалы и методы исследования

Для выделения спор S. endobioticum из почвенных образцов использовали метод флотации в четыреххлористом углероде, а также метод выделения ДНК зооспорангиев S. endobioticum с использованием готового набора реагентов «МетаГен/ MetaGen» с последующей идентификацией методом ПЦР «в реальном времени».

Образцы почвы, использованные для проведения экспериментов, описаны в табл. 1.

Таблица 1. Образцы почв, использованные для выделения спор S. endobioticum

Вариант	Образцы почвы	Количество спор гриба в 100 гр. почвы
1*	Искусственное заражение  (супесчаная почва)	5
2*	Искусственное заражение  (суглинистая почва)	5
3*	Искусственное заражение  (супесчаная почва)	50
4*	Искусственное заражение  (суглинистая почва)	50
5	Искусственное заражение  (супесчаная почва)	500
6	Искусственное заражение  (супесчаная почва)	5000
7	Искусственное заражение  (супесчаная почва)	20000
8	Московская обл., старый очаг (торфянистая почва)	Неизвестно
9	Московская обл., очаг (суглинистая почва)	Неизвестно
10	Воронежская обл., старый очаг  (супесчаная почва)	Неизвестно
11	Отрицательный контроль	0

*Данные варианты образцов почвы использовались только при испытании метода прямого выделения ДНК.

Для искусственного заражения почвы высушенные наросты рака картофеля, содержащие зимние зооспорангии патогена, растирали в фарфоровой ступке и просеивали через набор сит. Фракцию, собранную с сита диаметром 0,25 мкм, содержащую споры гриба, использовали для приготовления инфекционной суспензии, затем рассчитывали концентрацию зооспорангиев в 1 мл суспензии, которую смешивали с почвенной навеской.

Для выделения спор гриба методом флотации в четыреххлористом углероде использовали методику, разработанную Н.А. Дорожкиным и К.Е. Шариковым [13]. Подсчет выделенных спор проводился путем полного просмотра всплывшей органики в трех повторностях в каждом варианте опыта.

Математическую обработку экспериментальных данных выполняли в программе EXCEL с помощью надстройки «Анализ данных».

Выделение ДНК из образцов почвы проводили с использованием коммерческого набора реагентов «МетаГен/MetaGen». Особенностью набора является возможность напрямую выделять ДНК из почвенного образца, где содержатся сильные ингибиторы ПЦР реакции (гуминовые кислоты, вторичные метаболиты бактерий и грибов и др.) [14].

Воздушно-сухой образец почвы каждого варианта массой 100 г тщательно растирался в фарфоровой ступке, просеивался через сито с диаметром отверстий 0,5 мм. Из образца отбиралась навеска 150 мг в трехкратной повторности.

Работа выполнялась согласно инструкции производителя за исключением количества почвенного образца, взятого для выделения ДНК. Разработчиками рекомендовано использовать 250…300 мг для выделения ДНК, однако при тестировании набора возникли трудности с перемешиванием буфера с навеской 250 мг, что вызвало затруднения при выделении ДНК. Поэтому в дальнейших исследованиях использовалась навеска 150 мг.

Для идентификации выделенной из почвенных образцов ДНК использовали диагностический набор реагентов серии «Фитоскрин» «Synchytrium endobioticumРВ», который был нами предварительно апробирован.

Для определения аналитической чувствительности использовали суспензию зооспорангиев, которую готовили аналогично суспензии для искусственного заражения почвенных образцов, и применяли 3 повторности с уровнем зараженности 10⁰, 10¹, 10², 10³, 10⁴ клеток целевого организма на миллилитр. Затем из каждой концентрации отбирали по 100 мкл суспензии гриба в 3 повторностях и центрифугировали при 13000 об/мин. Супернатант сливали, не задевая осадка. Полученные образцы использовали для выделения ДНК.

В качестве отрицательного контроля использовали чистый образец, свободный от возбудителя рака картофеля.

ПЦР осуществляли на амплификаторе C1000 Touch CFX96 (BioRad).

Пороговым циклом считали Сt = 40, согласно рекомендациям производителя.

Набор реагентов «Synchytrium endobioticum-РВ» включает готовую реакционную смесь «S. Endo.-ВПК» (20 мкл на 1 образец), SynTaq ДНК-полимераза Т+ (0,5 мкл н 1 образец). К реакционной смеси добавляли 5 мкл ДНК образца. Условия амплификации: 95 ℃ — 300 с — 1 цикл; 60 ℃ — 40 с, 95 ℃ — 15 с — 45 циклов.

Для сравнительного анализа чувствительности Synchytrium endobioticumРВ проводили выделение ДНК из наростов рака картофеля с помощью наборов «МетаГен/MetaGen», «ДНК-Экстран-2» и «ФитоСорб-Автомат-48» производства ООО «НПФ Синтол».

Выделение ДНК с помощью набора «ФитоСорб-Автомат-48» было проведено с использованием автоматической станции НК TECAN.

Результаты исследования и обсуждение

Результаты выделения спор S. endobioticum из почвенных образцов методом флотации в четыреххлористом углероде приведены в табл. 2.

Таблица 2. Результаты выделения спор S. endobioticum с использованием метода флотации

Вариант	Количество спор гриба в 100 г почвы	Количество выделенных спор S. endobioticum из 100 г почвы	Эффективность выявления спор гриба, %
5	500	180,87 ± 44,9	36,17
6	5000	492,64± 53,66	9,85
7	20000	849,45 ± 54,52	4,24
8	Неизвестно	Не проводилось	—
9	Неизвестно	230,2 ± 44,7	—
10	Неизвестно	0	—
Отрицательный контроль К­	0	0	—

 

Полученные результаты показали, что эффективность метода флотации в четыреххлористом углероде очень мала, что связано с большими потерями зооспорангиев на разных стадиях выделения.

При работе с торфянистыми почвами (вариант 8) данный метод практически неприменим из-за большого количества всплывающей органики, что затрудняет обнаружение зооспорангиев и значительно увеличивает временные затраты на просмотр препаратов.

В результате тестирования набора для идентификации патогена «Synchytrium endobioticum-РВ» были получены экспоненциальные кривые флюоресценции накопления ДНК и значение порогового цикла Ct образцов, в которых FAM < 40, что подтвердило наличие патогена в исследуемых образцах и применимость тест-системы «Synchytrium endobioticum-РВ» для идентификации возбудителя рака картофеля.

Определена аналитическая чувствительность тест-системы. Было установлено, что порогом выявления ДНК возбудителя для данной тест-системы является 100% выявление при втором разведении ДНК, что составило 3×10³ клеток гриба/мл (табл. 3).

Таблица 3. Определение аналитической чувствительности Synchytrium endobioticum-РВ

Разведение ДНК	Концентрация клеток гриба, кл/мл	Synchytrium endobioticum­PB
		Значение порогового цикла Ct
		1	2	3
0	105	17.86	17.76	18.03
1	104	22.02	21.53	21.99
2	103	32.06	36.06	30.92
3	102	39,49	—	—
4	101	—	—	—
5	100	—	—	—
	К+	31.98	31,15	30,92
	К­в	—	—	—
	К­ч	—	—	—

 

Далее был проведен ряд экспериментов по выделению ДНК патогена непосредственно из зараженных образцов почвы. Необходимо отметить, что с помощью прямого метода происходит выделение тотальной ДНК, а дальнейшее проведение ПЦР «в реальном времени» позволяет определить наличие/отсутствие патогена в образце.

Результаты, полученные при тестировании почвы различной степени зараженности, различались незначительно. Так, при заражении почвы 500 зооспорангиев в 100 г почвы в среднем пороговый цикл Сt составил 36,6, при заражении 20 000 зооспорангиев в 100 г почвы — 33,9, а при заспоренности 5 000 зооспорангиев в 100 г почвы — 33,3 (табл. 4). При этом наблюдается высокое различие в проворностях по пороговым циклам. Такие результаты могли возникнуть по ряду причин. Например, при просеивании образцов почвы и подготовке навески неизменно теряется неопределенная часть спор гриба.

Таблица 4. Результаты выделения ДНК из образцов почвы с последующей идентификацией с помощью ПЦР «в реальном времени»

Образец	Количество спор гриба в 100 г почвы	Значение порогового цикла Ct
		1	2	3
1	5	—	—	—
2	5	—	—	—
3	50	39,61	—	—
4	50	39,24	—	—
5	500	35,42	35,10	39,47
6	5000	34,16	32,21	33,49
7	20000	34,41	32,80	34,65
8	Неизвестна	38,15	28,74	33,88
9	Неизвестна	37,41	35,55	36,97
10	Неизвестна	41,61	33,20	33,56
11	0	—	—	—
К+*	—	33.48	31.98	32.17
К+з**	—	17.86	17.76	18.03
К­в	—	—	—	—
К­ч	—	—	—	—

* Положительный контроль набора «Synchytrium endobioticum-РВ».
** Положительный контроль, ДНК, выделенная из нароста рака картофеля.

 

Кроме того, одной из причин, могут быть сами компоненты, входящие в набор для выделения ДНК, которым может не хватает связывающей способности, так как в почве находятся другие организмы, ДНК которых также выделяется при использовании набора. Слишком большое количество биомассы может приводить, с одной стороны, к ингибированию, а с другой, к связыванию с сорбирующими частицами нецелевых молекул ДНК, «конкурируя» с молекулами ДНК исследуемого патогена.

В связи с нелинейным и случайным колебаниями циклов при различной концентрации ДНК невозможно точно определить степень заражения образцов.

Таким образом, метод выделения зооспорангиев с использованием флотации в четыреххлористом углероде не превосходит по чувствительности метод прямого выделения ДНК патогена из почвы: при использовании обоих методов удалось выявить патоген при концентрации 500 зооспорангиев на 100 г почвы. Кроме того, при проведении экспериментов ДНК патогена обнаружили в образцах почвы из старого очага Воронежской области, что не удалось сделать методом флотации.

Преимуществом молекулярного метода является возможность работы с торфянистыми почвами.

Заключение

Проведен сравнительный анализ двух методов выявления и идентификации возбудителя рака картофеля при прямом тестировании почвы — метода флотации в четыреххлористом углероде и метода выделения ДНК из образцов почвы с дальнейшей идентификацией с помощью ПЦР «в реальном времени». Показано, что оба метода сопоставимы по чувствительности. Кроме того, использование молекулярного метода позволяет тестировать любой тип почвы.

Таким образом, метод прямого выделения ДНК из почвы с последующей постановкой ПЦР «в реальном времени» может быть использован как альтернатива методу флотации с использованием токсичных веществ.

Об авторах

Юлия Владиславовна Цветкова

Всероссийский центр карантина растений (ВНИИКР); Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: yutska@mail.ru

младший научный сотрудник лаборатории микологии испытательного лабораторного центра, Всероссийский центр карантина растений; аспирант биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

140150, Российская Федерация, Московская обл., г. Раменское, р.п. Быково, ул. Пограничная, д. 32; 119234, Россия, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12

Вера Алексеевна Яковлева

Всероссийский центр карантина растений (ВНИИКР)

Email: yakovleva_va@mail.ru

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник - начальник отдела фитосанитарной биологии

140150, Российская Федерация, Московская обл., г. Раменское, р.п. Быково, ул. Пограничная, д. 32

Список литературы