Структура геномной ДНК в популяциях кур, выявляемая мультилокусным ДНК-зондом

Полный текст

Введение

Генетический анализ ДНК кур различных пород позволяет установить их исторические взаимоотношения, направления селекции, уточнить происхождение пород, биологическое разнообразие и выявить ассоциации отдельных участков генома с продуктивными признаками [1–3]. Особенно актуальны такие исследования в отношении малочисленных генофондных пород и популяций [4, 5]. В ряде случаев выведение новых пород происходило путем скрещиваний различных групп птицы с последующим закреплением нужных фенотипов. При этом «следы» самых различных пород могут выявляться при анализе распределения однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) на чипах высокой плотности [6, 7]. Нужно отметить, что интенсивная селекция на продуктивные признаки может снизить вариабельность генов, определяющих резистентность у птицы [8, 9].

В программах скрещивания при создании гибридных форм можно использовать генофондные породы с уникальными генами [10]. С практической точки зрения важно понять вклад каждой породы в конечный результат. Описаны случаи интрогрессии генов от промышленных высокопродуктивных пород генофондным [11]. Поддержание необходимого уровня разнообразия в популяциях — необходимый элемент в селекционной работе. Известно, что снижение генетического разнообразия выражается в виде инбредной депрессии с проявлением целого комплекса негативных последствий [12, 13]. Причиной этого считается переход вредных рецессивных аллелей, не экспрессирующихся в гетерозиготном состоянии, в гомозиготное состояние. В последнее время доказывают также, что при инбридинге возможны изменения в метилировании ДНК, что выражается в депрессии [14].

Цель исследования — выявить популяционно-­генетические параметры, такие как межпопуляционное разнообразие (коэффициент сходства и генетическое расстояние), внутрипопуляционное разнообразие (гетерозиготность), в шести породах и популяциях кур.

Материалы и методы исследований

В исследовании использовали биоматериал (кровь из подкрыльцовой вены), полученный из особей (n = 10–15) кур шести популяций Биоресурсной коллекции Всероссийского научно-­исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных (ВНИИГРЖ). Для предотвращения сворачивания крови в пробирку помещали 1 каплю 0,5 М раствора этилендиаминотетрауксусной кислоты (ЭДТА). Клетки лизировали в буфере TES (50 мМ трис, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ NaCL, рН 8,0), содержащим 0,5 % раствор додецилсульфата. Параллельно в раствор вносили протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/ мл, обеспечивающей расщепление белков смеси. После проведения инкубации при 60 °C в пробирки вносили равный объем водонасыщенного фенола, встряхивали и центрифугировали для полного разделения фаз. Верхнюю фазу с ДНК отбирали в новую пробирку, ДНК осаждали этанолом и растворяли в буфере ТЕ (10 мМ трис, 1 мМ ЭДТА).

Геномную ДНК расщепляли эндонуклеазой рестрикции HaeIII, полученные фрагменты ДНК разделяли по длине в агарозном геле, переносили на нейлоновый фильтр, фиксировали в ультрафиолетовом свете, проводили реакцию молекулярной гибридизации с меченым олигонуклеотидным зондом (ГТГ) 5, как описано ранее [5]. Анализ количества и распределения фрагментов ДНК на фильтре позволил рассчитать попарное сходство между особями как внутри каждой популяции, так и между популяциями. Доля общих фрагментов ДНК выражалась коэффициентом сходства (BS). Гетерозиготность рассчитывали по формуле [15, с. 732] с использованием программы Gelstats™. Филогенетические древа строили с использованием программы Statistica 6.0™ (модуль программы Cluster analysis). Основные этапы экспериментальной работы приведены на рис. 1.

Рис. 1. Схематическое изображение основных этапов проведения мультилокусного анализа

Fig. 1. Outline of main experimental stages of multilocus analysis

Результаты исследования и обсуждение

В первом эксперименте были определены популяционно-­генетические параметры в трех популяциях кур следующих пород: юрловская голосистая, черно-­пестрый австралорп и голошейная (табл. 1). Наибольшее генетическое расстояние наблюдалось между черно-­пестрым австралорпом и голошейной (D = 0,155), а также между юрловской голосистой и голошейной (D = 0,145), из чего следует, что данные породы имеют разные корни в происхождении. Относительную близость показали куры юрловской голосистой и черно-­пестрого австралорпа. Более разнообразной группой является голошейная, в особях которой доля общих фрагментов ДНК при попарном сравнении была наиболее низкой (BS = 0,32).

Таблица 1
Популяционно-генетические параметры в 3 популяциях кур (юрловская голосистая, черно-пестрый австралорп, голошейная),  полученные методом ДНК-фингерпринтинга

Популяции кур	n	Полос на дорожку, X ± m	P	BS1	BS2	D
Юрловская голосистая Черно-пестрый австралорп	10 11	27,7 ± 0,9 27,4 ± 0,5	9,2 × 10–13 6,9 × 10–12	0,37 0,39	0,29	0,090
Юрловская голосистая Голошейная	10 11	27,7 ± 0,9 22,7 ± 1,6	9,2 × 10–13 4,6 × 10–12	0,37 0,32	0,20	0,145
Черно-пестрый австралорп Голошейная	11 11	27,4 ± 0,5 22,7 ± 1,6	6,9 × 10–12 4,6 × 10–12	0,39 0,32	0,20	0,155

Примечание. P — вероятность встречаемости двух особей с идентичным набором всех фрагментов ДНК; BS¹ — коэффициент сходства внутри групп; BS² — коэффициент сходства между группами; D — генетическое расстояние.

Table 1
Population and genetic parameters in 3 chicken populations (Yurlov Crowers, Black-and-White Australorp and Bald-necked chickens) generated by DNA fingerprinting

Chicken population	n	Bands per lane, X ± m	P	BS1	BS2	D
Yurlov Crowers Black-and- White Australorp	10 11	27.7 ± 0.9 27.4 ± 0.5	9.2 × 10–13 6.9 × 10–12	0.37 0.39	0.29	0.090
Yurlov Crowers Bald-necked chickens	10 11	27.7 ± 0.9 22.7 ± 1.6	9.2 × 10–13 4.6 × 10–12	0.37 0.32	0.20	0.145
Black-and- White Australorp Bald-necked chickens	11 11	27.4 ± 0.5 22.7 ± 1.6	6.9 × 10–12 4.6 × x10–12	0.39 0.32	0.20	0.155

Note. P — the probability of occurrence of two individuals with an identical set of all DNA fragments; BS¹ — coefficient of similarity within groups; BS² — coefficient of similarity between groups; D — genetic distance.

Поиск специфических фрагментов ДНК в первых трех изучаемых популяциях (табл. 2) привел к выявлению фрагментов ДНК № 108 и 112 — маркерные фрагменты для черно-­пестрого австралорпа, встречаются с частотой (0,91), но у особей голошейной и юрловской голосистой пород они не встречаются вообще либо имеют низкую частоту встречаемости.

Таблица 2
Специфические фрагменты ДНК и аллели, имеющие разную частоту встречаемости в 3 популяциях кур (юрловская голосистая, черно-пестрый австралорп и голошейная), рассчитанные методом ДНК-фингерпринтинга

Фрагмент ДНК	Частота фрагментов ДНК			Частота встречаемости аллелей q = 1 — √1 — p
	I	II	III	I	II	III
85	0,80	0,27	0,18	0,55	0,15	0,09
106	0,10	0,00	0,73	0,05	0,00	0,48
108	0,60	0,91	0,00	0,37	0,68	0,00
112	0,00	0,91	0,18	0,00	0,05	0,09

Примечание. I — юрловская голосистая; II — черно- пестрый австралорп; III — голошейная; p — частота встречаемости фрагмента ДНК в популяции.

Table 2
Specific DNA fragments and alleles with different frequency of occurrence in 3 chicken populations (Yurlov Crower, Black-and-White Australorp and Bald-necked chicken) calculated by DNA fingerprinting

DNA fragment	DNA fragment frequ		ency	Frequency of allele occurrence q = 1 — √1 — p
	I	II	III	I	II	III
85	0.80	0.27	0.18	0.55	0.15	0.09
106	0.10	0.00	0.73	0.05	0.00	0.48
108	0.60	0.91	0.00	0.37	0.68	0.00
112	0.00	0.91	0.18	0.00	0.05	0.09

Note. I — Yurlov Crower; II — Black-and-W hite Australorp; III — Bald-necked chicken; p — frequency of DNA fragment in population.

Расчеты, проведенные на выявление внутрипопуляционного генетического разнообразия в этих популяциях кур (табл. 3), подтвердили предположение о том, что наиболее разнообразной популяцией являются особи голошейной породы, показавшие наибольшую гетерозиготность (H = 0,76). Тем не менее достаточно высокая гетерозиготность наблюдалась и у других пород (H = 0,71).

Таблица 3
Гетерозиготность H в 3 популяциях кур: юрловская голосистая,  черно-пестрый австралорп, голошейная

Популяции кур	n	Число локусов	Число аллелей	Число полиморфных локусов	H
Юрловская голосистая	10	16,16	5,88	1,00	0,71
Черно-пестрый австралорп	11	16,05	5,48	1,00	0,71
Голошейная	11	12,91	6,50	1,00	0,76

Table 3
Heterozygosity (H) in three chicken populations: Yurlov Crower,  Black-and-White Australorp and Bald-necked chicken

Chicken population	n	Number of loci	Number  of alleles	Number  of polymorphic loci	H
Yurlov Crower	10	16.16	5.88	1.00	0.71
Black-and-White Australorp	11	16.05	5.48	1.00	0.71
Bald-necked chicken	11	12.91	6.50	1.00	0.76

Известно, что голошейные куры — редкая генофондная порода народной селекции, разводимая в условиях коллекционариев и у любителей. Признак голошейности имеет генетическую природу, наследуется как доминантный, стойко передается потомству. Порода не скрещивается с другой птицей и содержится в изолированном состоянии на протяжении длительного времени, что обусловливает генетическую удаленность. Эти представления наглядно проиллюстрированы построением филогенетического древа как с использованием значений коэффициента сходства, так и генетических расстояний (рис. 2).

Аналогичная работа была проведена на трех популяциях кур павловской породы: особи из Биоресурсной коллекции ВНИИГРЖ, куры из Московской области, куры из фермерского хозяйства Барнаула (табл. 4). Наибольшим коэффициентом сходства внутри породы отличались павловские куры из Московской области (BS1 = 0,58), а наименьшим — куры из Биоресурсной коллекции ВНИИГРЖ (BS1 = 0,39), но тем не менее по генетическим расстояниям они очень близки (D = 0,055). Наиболее выраженная генетическая дистанция определялась между павловскими курами из Барнаула и Московской области (D = 0,105), а также между курами из Барнаула и экспериментального хозяйства ВНИИГРЖ (D = 0,100).

Рис. 2. Филогенетическое древо, показывающее генетические взаимоотношения в породах кур по данным программы Statistica 6.0™ (модуль Cluster analysis): Var1 — юрловская голосистая; Var2 — черно-пестрый австралорп; Var3 — голошейная. По оси ординат — условные единицы генетического расстояния
Fig. 2. Phylogenetic tree showing genetic relationships in chicken breeds according to the Statistica 6.0™ program (Cluster analysis module): Var1 — Yurlov Crowers, Var2 — Black-and-White Australorp, Var3 — Bald-necked chicken. On the y-axis — conventional units of genetic distance

 

Таблица 4
Популяционно-генетические параметры в 3 популяциях кур  павловской породы (ВНИИГРЖ, Московская обл., Барнаул),  полученные методом ДНК-фингерпринтинга

Группы кур	n	Количество полос на дорожку X ± m	Р	BS1	BS2	D
Павловская ВНИИГРЖ Павловская Моск. обл.	15 12	10,6 ± 0,9 13,6 ± 0,9	4,7 × 10–5 5,5 × 10–4	0,39 0,58	0,43	0,055
Павловская ВНИИГРЖ Павловская Барнаул	15 13	10,6 ± 0,9 15,0 ± 1,4	4,7 × 10–5 7,5 × 10–5	0,39 0,53	0,36	0,100
Павловская Моск. обл. Павловская Барнаул	12 13	13,6 ± 0,9 15,0 ± 1,4	5,5 × 10–4 7,5 × 10–5	0,58 0,53	0,45	0,105

Table 4
Population and genetic parameters in 3 groups of Pavlov chickens (RRIFAGB, Moscow region, Barnaul), as revealed by DNA fingerprinting

Chiken group	n	Bands per lane, X ± m	Р	BS1	BS2	D
Pavlov RRIFAGB Pavlov Moscow region	15 12	10.6 ± 0.9 13.6 ± 0.9	4.7 × 10–5 5.5 × 10–4	0.39 0.58	0.43	0.055
Pavlov RRIFAGB Pavlov Barnaul	15 13	10.6 ± 0.9 15.0 ± 1.4	4.7 × 10–5 7.5 × 10–5	0.39 0.53	0.36	0.100
Pavlov Moscow region Pavlov Barnaul	12 13	13.6 ± 0.9 15.0 ± 1.4	5.5 × 10–4 7.5 × 10–5	0.58 0.53	0.45	0.105

Заключение

ДНК-зонд (ГТГ)5 может эффективно использоваться при выяснении особенностей организации генома у кур различных пород и популяций. С его помощью можно рассчитать основные популяционно-­генетические параметры, такие как коэффициент сходства, средняя гетерозиготность и генетические расстояния.

Об авторах

Валерий Павлович Терлецкий

Федеральный исследовательский центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста

Автор, ответственный за переписку.
Email: valeriter@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4043-3823
SPIN-код: 4512-5328

доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник, лаборатория молекулярной генетики, Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных

Российская Федерация, 196625, г. Санкт-Петербург, г. Пушкин, пос. Тярлево, Московское ш., д. 55а

Валентина Ивановна Тыщенко

Федеральный исследовательский центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста

Email: tinatvi@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4964-9938
SPIN-код: 6294-2400

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики, Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных

Российская Федерация, 196625, г. Санкт-Петербург, г. Пушкин, пос. Тярлево, Московское ш., д. 55а

Список литературы

Дополнительные файлы