Цитологические и микробиотические аспекты диагностики наружных отитов у собак

Полный текст

Введение

Наружный отит (НО) — частое патологическое состояние у мелких домашних животных [1], встречаетсяся у 5…20 % в клиническом представительстве собак [2, 3] и 2 % — кошек [4].

Терапевтическое вмешательство при НО зависит от определения всех первичных и вторичных причинных факторов, имеющих негативные последствия [3]. Выявление первичных причин НО является наиболее важным фактором лечения, особенно в хронических случаях [5]. Терапевтическая тактика базируется на этиотропном и патогенетическом методах, в которых основополагающая роль в устранении вторичных факторов принадежит антимикробной терапии — устранению развивающего и поддерживающего патологический процесс факторов.

Антимикробная терапия всегда основывается как на общем знании видового превалитета в условиях наружного слухового прохода (НСП), так и на полученной информации о частном, конкретном составе микробиома у отдельного больного животного. Для достижения этой цели клиницист проводит отбор содержимого НСП для цитологического исследования и микробиологических исследований (для определения чувствительности выделенных организмов к антимикробным препаратам), причем последнее может быть императивным при неразрешающемся отите и неоднократных попытках эмпирической терапии [6].

При отборе материала на цитологическое исследование ушной тампон вводят в канал (не пропуская его через конус отоскопа), поворачивают и извлекают. Затем его раскатывают на предметное стекло и окрашивают. Наиболее часто для окрашивания отобранного материала используют коммерчески доступные наборы красок по Райт — Гиемза или Дифф — Квик [6], хотя в некоторых случаях иногда выполняется окрашивание по Граму [7]. На основании микроскопического исследования образца выявляют дрожжи или бактерии и может быть начато соответствующее лечение. Из числа дрожжевых организмамов обычно выделяют Malassezia pachydermatis [1, 8, 9].

Среди бактерий наиболее встречаемый микроорганизм — Staphylococcus Pseudintermedius [1]. Среди кокковых форм иногда также встречаются Staphylococcus aureus [7] и Staphylococcus schleiferi [10]. Из бактерий палочковидной формы чаще выявляют Pseudomonas aeruginosa [1], хотя Proteus mirabilis [11] или другие грамотрицательные бактерии, такие как Escherichia coli [11], Corynebacterium spp. [11], могут также встречаться.

Без проведения цитологического исследования содержимого НСП невозможно обоснованно назначать эмпирическую антимикробную терапию. Среди отечественных исследований отсутствует достоверная информация о воспроизводимости данных, полученных после однократного отбора проб для цитологического исследования при НО у собак. Цель проспективного исследования — сравнение цитологических образцов из двух последовательно взятых мазков, полученных из ушных каналов собак с НО, и определение минимально необходимого количества взятия проб для получения актуальной информации о степени микробиологической обсемененности пораженных слуховых проходов.

Материалы и методы исследования

Исследуемая популяция. Собаки с наружным отитом, представленные в ветеринарные клиники г. Москвы и Московской области, рассматривались для исследования независимо от того, было ли заболевание в анамнезе хроническим или острым. Критериями включения были НО по крайней мере в одном ухе и цитологическое исследование, выявляющее микробные организмы и/или воспалительные клетки. У всех собак наблюдались клинические признаки, такие как тряска головой, почесывание ушей и/или эритема слухового прохода, либо в анамнезе, либо во время очного приема. У всех животных наблюдалось набухание при отоскопическом исследовании, были обнаружены выделения из уха, признаки воспаления в НСП. Из обоих ушей каждой из собак были взяты три последовательно отобранных образца стерильными аппликаторами. Первый образец использовали для немедленного исследования: он был окрашен по стандартной методике Diff-­Quick и оценивался микроскопически. В случае если на 20 и более микроскопических областях с увеличением в 1000 раз (на высоком поле увеличения (ВПУ)) наблюдалось не менее пяти дрожжевых клеток, или не менее пяти кокков, или не менее одной палочки, или наличие воспалительных клеток, таких как нейтрофильные гранулоциты, результаты считали указывающими на инфекцию [12], и животное, от которого были получены такие образцы, включали в исследование.

Отбор образцов. Вторые и третьи образцы были получены с использованием стерильного аппликатора с ватным наконечником. Животное было зафиксировано либо владельцем, либо сотрудником ветеринарного предприятия. Ветеринарный врач, участвующий в проведении исследования, вводил аппликатор (для второго образца) в слуховой проход до легкого сопротивления (стык между вертикальной и горизонтальной частью НСП), делал аппликатором круговое движение и удалял. Ту же процедуру незамедлительно проводили с третьим аппликатором.

Обработка образцов. Материал с наконечника каждого из аппликаторов наносили на предметное стекло перекатывающими движениями таким образом, чтобы на каждом предметном стекле было четыре одиночных параллельных мазка — по два с каждого уха одной и той же собаки. Предметные стекла высушивали на воздухе в течение одного часа и окрашивали по стандартной методике Diff-­Quick. Все образцы были проанализированы одним и тем же исследователем с использованием вертикального светового микроскопа (Микромед 2 (вар. 2–20)) со 100‑кратным объективом без масла. Исследование было начато при маломощном увеличении (×40), чтобы определить репрезентативную и легко оцениваемую область в каждом из этих полей на основе толщины мазка, качества окрашивания и минимального количества артефактного мусора. Фактический подсчет проводился при увеличении в 1000 раз (ВПУ). Бактерии дифференцировали по форме на кокки и палочки.

Статистическая оценка. Количество бактерий и грибов в двух образцах сравнивали при помощи теста подобранных пар Уилкоксона. Качественную согласованность между двумя последовательными мазками определяли при помощи κ (каппа)-теста. Данный метод был использован, так как невозможно выбрать какой‑либо один из образцов в качестве золотого стандарта для расчета чувствительности и специфичности. Если две последовательные выборки не были согласованы, то это приводило к снижению κ-индекса. Для определения породной предрасположенности к наружному отиту был использован критерий хи-квадрат; контрольную популяцию составили собаки, поступившие в ветеринарную клинику в течение того же периода времени. Статистическая значимость была определена как Р < 0,05.

Результаты исследования и обсуждение

Исследуемая популяция. В исследование были включены 166 собак с НО. Клинически у 136 пациентов был двусторонний отит, а у 30 — односторонний. Среди них было 24 собаки смешанных пород, 18 кокер-­спаниелей, 12 французских бульдогов, 10 мопсов, по 8 вест-хайленд терьеров, фокстерьеров и бассет-­хаундов, по 6 биглей, китайских шарпеев, мопсов и миниатюрных пуделей. Все остальные породы были представлены только одним или двумя животными. Кокер-спаниели (точный критерий Фишера, Р = 0,0006) и французские бульдоги (точный критерий Фишера, Р = 0,0123) были выявлены предрасположенными к НО. 78 собак были самцами (32 из которых были кастрированы) и 88 — самками (52 из которых были кастрированы). Не было выявлено предрасположенности к НО, связанной с полом (точный критерий Фишера, Р = 0,435). У 136 собак были отвисшие ушные раковины, а у 30 — стоячие. НО чаще встречался у собак с отвисшими ушными раковинами, чем у собак с прямостоячими (точный критерий Фишера, Р = 0,0009).

Выборочная оценка. 166 собак соответствовали критериям включения, однако у 30 из них цитологические результаты соответствовали критериям включения только в одном ухе, и поэтому в результаты были включены только данные, относящиеся к 302 ушам. Результаты микроскопической оценки обобщены в табл. 1. Не обнаружено существенной разницы между образцами 2 и 3 от любого данного животного с точки зрения количества микроорганизмов (тесты подобранных пар Уилкоксона, Р = 0,9214 для дрожжей, Р = 0,1001 для кокков и Р = 0,5781 для палочек). Дрожжи обнаружены в 282 ушах: в 258 из них (91 %) они присутствовали в обоих образцах, в 16 ушах (6 %) — только в образце 2, а в 8 ушах (3 %) — только в образце 3 (табл. 2). Кокки были выявлены в 246 ушах: в 196 из этих ушей (80 %) — в обоих образцах, в 28 (11 %) — только в образце 2, и еще в 22 (9 %) — только в образце 3. Палочки присутствовали в 38 ушах: в 22 (58 %) из этих ушей — в обоих образцах; в 12 (32 %) — только в образце 2; и в 4 (11 %) — только в образце 3. Выявлено существенное согласование результатов образцов 2 и 3 в отношении наличия кокков (k = 0,765) и палочек (k = 0,705). Для дрожжей согласие было лишь умеренным (k = 0,581). Из 30 собак с односторонней микробной инфекцией уха дрожжевые грибки присутствовали у 28 (93 %), кокки — у 26 (87 %) и палочки — у 6 (20 %). Большинство цитологических образцов показали комбинацию различных микроорганизмов (табл. 3). Палочки присутствовали только в ассоциации с другими микроорганизмами. В образцах, взятых из 24 (18 %) ушей, присутствовали все три типа организмов.

Таблица 1. Количество микроорганизмов на двух последовательных мазках, полученных из ушей 41 собак с НО, описательная статистика

Форма микроорганизма	Среднее арифмитическое	Медиана	Стандартное отклонение	Доверительный интервал
Кокки
Проба 1	109	24	240	71…149
Проба 2	209	26	590	89…311
Палочки
Проба 1	235	54	341	60…410
Проба 2	275	139	319	82…468
Дрожжи
Проба 1	54	15	109	36…70
Проба 2	58	17	125	39…80

Table 1. Number of microorganisms on two consecutive swabs obtained from ears of 41 dogs with otitis externa, descriptive statistics

Microorganism	Arithmetic mean	Median	Standard deviation	Confidence interval
Cocci
Sample 1	109	24	240	71…149
Sample 2	209	26	590	89…311
Bacilli
Sample 1	235	54	341	60…410
Sample 2	275	139	319	82…468
Yeasts
Sample 1	54	15	109	36…70
Sample 2	58	17	125	39…80

Таблица 2. Цитологические данные микроорганизмов двух последовательных мазков, взятых из 302 ушей собак с НО

Микроорганизмы	Позитивные результаты	Одинаковые результаты	Разные результаты	Доля разных результатов, %
Кокки	246	196	50	20
Палочки	38	22	16	42
Дрожжи	282	258	24	9

Table 2. Cytological data of microorganisms of two consecutive smears taken from 302 ears of dogs with external otitis

Microorganisms	Positive results	Similar results	Different results	Percentage of different results
Cocci	246	196	50	20
Bacilli	38	22	16	42
Yeasts	282	258	24	9

Таблица 3. Количество и процентное соотношение различных комбинаций микроорганизмов в ушах собак с наружным отитом

Ассоциативность микроорганизмов	Дрожжи, ед. (%)	Кокки, ед. (%)	Палочки, ед. (%)
Не в комбинации (единственный организм)	58 (19)	24 (8)	0
В комбинации
с дрожжами	—	180 (60)	2 (0,7)
кокками	180 (60)	—	6 (2)
палочками	2 (0,7)	6 (2)	—

Table 3. Number and percentage of different combinations of microorganisms found in ears of dogs with otitis externa

Associativity of microorganisms	Yeasts (%)	Number of cocci (%)	Bacilli (%)
Not in combination (single organism)	58 (19)	24 (8)	0
In combination with:
Yeasts	—	180 (60)	2 (0.7)
Cocci	180 (60)	—	6 (2)
Bacilli	2 (0.7)	6 (2)	—

Не обнаружено существенной разницы в количестве микроорганизмов, присутствующих в двух образцах цитологического мазка из уха, взятых последовательно из одного и того же уха в одном и том же месте наружного слухового прохода. Согласование между образцами 2 и 3 было значительным в отношении присутствия кокков и палочек и умеренным в отношении присутствия дрожжей.

В большинстве цитологических образцов (73 %) обнаружено более одного типа микроорганизмов, исключительные случаи присутствия кокков или дрожжей были редкими (8 и 19 % соответственно). Палочки никогда не присутствовали обособленно от других типов микроорганизмов. Наблюдалась тенденция к тому, что количество микроорганизмов, идентифицированных в третьем образце, было незначительно выше, чем во втором, хотя это не было статистически значимым. Возможно, это произошло из-за разрыхления остатков в ухе вторым тампоном, а это означает, что третьим было собрано больше.

Микробы могут быть неравномерно распределены в слуховом проходе, и наблюдаемые различия в плотности могут быть просто отражением этих различий. Таким образом, авторы не считают, что различия в цифрах имеют клиническое значение, особенно учитывая, что различия в цифрах были незначительными. В этом исследовании обнаружено, что кокер-­спаниели и французские бульдоги предрасположены к развитию НО. Сообщалось также, что эти породы предрасположены к атопическому дерматиту [13–15]. Учитывая, что примерно у 50 % собак с атопическим дерматитом также имеется НО в качестве клинического признака [13], такая породная предрасположенность не удивительна. Собаки, принадлежащие к породам с отвисшими ушными раковинами, составляли большинство собак с наружным отитом, включенных в это исследование. Это согласуется с предыдущими исследованиями, показывающими, что у собак этих типов наружный отит развивается чаще, чем у собак с прямостоячими ушными раковинами [14, 15]. Неясно, существует ли у собак половая предрасположенность к наружному отиту [4]. Настоящее исследование также не показало половой предрасположенности к наружному отиту у собак.

Заключение

Представленные данные характеризуют цитологические и микробиотические аспекты патогенетики НО у собак, которые могут быть использованы в диагностике и определении эффективной терапевтической тактики. Проведенное исследование подтверждает воспроизводимость метода взятия образцов для цитологического исследования, используемого для индикации и установления формы микроорганизмов, вовлеченных в развитие НО у собак. Полученные данные свидетельствуют о том, что, в случаях НО у собак воспроизводимость цитологической картины при однократном отборе материла, как правило, отражает актуальный этап патогенеза заболевания и предоставляет оптимальную возможность выявления местной пролиферативной активности условно-­патогенной микробиоты, а также соответствующего воспалительного ответа макроорганизма.

Об авторах

Егор Анатольевич Пустовит

Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина

Email: egor_pustovit@mail.ru
SPIN-код: 6055-0918
аспирант кафедры иммунологии и биотехнологии факультета биотехнологии и экологии 109472, Российская Федерация, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23 с6

Николай Васильевич Пименов

Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина

Автор, ответственный за переписку.
Email: pimenovnikolai@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1658-1949
SPIN-код: 1911-3815

доктор биологических наук, профессор кафедры иммунологии и биотехнологии факультета биотехнологии и экологии

109472, Российская Федерация, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23 с6

Список литературы