Эффекты оксида азота, связанные с экспрессией ряда генов на эмбриональной стадии развития птиц

Полный текст

Введение

Согласно данным ряда исследователей, оксид азота (NO) оказывает влияние на экспрессию ряда генов [1–3], в т. ч. генов, связанных с миогенезом [4]. До сих пор не было возможности оценить этот эффект количественно и определить перспективы его использования, так как контроль содержания метаболитов NO в тканях методически сложен. Благодаря использованию высокочувствительного и высокоспецифичного ферментного сенсора, позволяющего производить такой контроль [5], мы установили, что в птичьем эмбрионе около 2 % аргинина тратится на синтез оксида азота [6]. Интенсивность синтеза NO примерно одинаковая во всех эмбрионах птиц одного вида. Но в эмбрионах мясных форм NO, преимущественно, окисляется до нитрата, в то время как в эмбрионах яичных форм он накапливается в составе так называемых соединений — доноров NO: S-нитрозотиолов (RSNO), динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ), высокомолекулярных нитратов (RNO₂). Разница по показателю соотношения нитрата и соединений — доноров в эмбрионе достигает двух порядков [6, 7].

Очевидно, что для обеспечения жизненно необходимых физиологических процессов оксид азота в птичьем эмбрионе синтезируется в избыточном количестве. Об этом говорит хотя бы тот факт, что в эмбрионах мясных форм NO, в основном, окислен до нитрата [6]. Было показано, что со степенью окисления NO в эмбрионе коррелируют некоторые гистологические показатели эмбриональных мышц [6]. В связи с данными о влиянии NO на экспрессию генов [1–4], можно предположить, что основная часть оксида азота в эмбрионе выполняет роль регулятора экспрессии генов, в частности, ответственных за миогенез. Мы имеем возможность количественно оценить этот эффект и практически использовать его в птицеводстве.

Цель исследования — выяснить взаимосвязь содержания NO в тканях птичьих эмбрионов и экспрессии генов, ответственных за миогенез, на различных стадиях эмбриогенеза.

Материалы и методы исследования

В экспериментах использовали оплодотворенные яйца следующих пород и кроссов кур: кросс «Смена 9» (порода корниш (линия СМ 56), порода плимутрок (линия СМ 79) и исходный гибрид), кроссы Хайсекс белый и Хайсекс коричневый, породы Мини мясные (линия А77), Куланги, Брама Палевая, Юрловская голосистая и Орловская, а также перепелов породы японская серая, полученные в ООО «Генофонд» (Россия). Инкубацию яиц проводили в условиях инкубатория (ФГБУ СГЦ «Загорское», ЭПХ ВНИТИП, г. Сергиев Посад, Московская обл.). Использовали инкубаторы ИПХ‑10 (Россия). Температура в инкубационный период (с 1 по 18 сутки инкубации) — 37,6 °C, в выводной период (с 19 по 21 сутки инкубации) — 37,2 °C в соответствии с рекомендациями ВНИТИП [10].

Во всех случаях для определения экспрессии генов отобрали по 5…8 эмбрионов каждой породы или кросса.

Для определения содержания нитро- и нитрозосоединений в гомогенатах использовали ферментный сенсор, действие которого основано на уникальной способности нитрита и других нитрозосоединений, имеющих в составе NO⁺-группу, ингибировать каталазу в присутствии галоид-­ионов с примерно равной эффективностью, одинаково зависящей от рН-среды [5–8]. Способность ингибировать фермент утрачивается под действием ряда веществ, специфичных для каждой группы нитрозосоединений [5]. Для определения нитросоединений использовали треххлористый ванадий для восстанавления нитрогруппы в нитрозогруппу, имеющую способность ингибировать каталазу. Чувствительность метода — 40 нМ [5, 7].

Экспрессию генов изучали на основе метода ПЦР-РВ [9]. В качестве контроля взяли ген «домашнего хозяйства» — ТАТА-связывающий белок (TBP), так как на его экспрессию нитроаргинин и аргинин не оказывали эффекта.

Из гомогенизированной ткани выделяли РНК, проводили синтез к ДНК методом ПЦР с обратной транскрипцией. Расчет экспрессии генов-­кандидатов в количественной детекции ПЦР-РВ определяли относительно контрольного гена ТВР при помощи метода 2^–ΔΔCT [9], где Cт — ПЦР-цикл, в котором флуоресцентный сигнал от красителя пересекает установленный пороговый уровень. Таким образом, чем меньше величина Ст, тем интенсивнее идет процесс амплификации и, следовательно, более высокая экспрессия гена.

На шестые-­седьмые сутки эмбриогенеза из-за сложности отбора мышечной ткани получали гомогенат эмбриона с помощью стеклянного гомогенизаторе DWK Life Sciences GmbH, Германия (8 мин, 40 фрикций/мин, 6 °C). На 13–14‑е сутки развития получали гомогенат грудных и бедренных мышц эмбриона, используя измельчитель тканей Oster (Мексика).

Для установления зависимости между содержанием депонированного NO в тканях и экспрессией исследуемых генов в яйца перед закладкой и на 11‑е сутки инкубации вводили растворы экзогенных веществ: блокатора синтеза оксида азота — нитроаргинина (H), а также смесь нитроаргинина и субстрата синтеза оксида азота — аргинина (Н+А). Дозировка указана в табл. 3, 4. В контрольную группу (К) в эти же сроки вводили стерильный физиологический раствор. Ввод в яйцо осуществлялся через скорлупу со стороны воздушной камеры инсулиновыми шприцами. Использовали препараты Nω-нитро-­L-аргинина и L-аргинина Merck, разведение осуществляли на стерильном физиологическом растворе.

Для статистической обработки применяли пакет программ BioStat.

Инкубацию проводили в условиях вивария (ФГБУ СГЦ «Загорское», ЭПХ ВНИТИП, г. Сергиев Посад, Московская обл.). Использовали инкубаторы ИПХ‑10 (Россия). Температура в инкубационный период (с 1‑х по 18‑е сутки инкубации) — 37,6 °C, в выводной период (с 19‑х по 21‑е сутки инкубации) — 37,2 °C в соответствии с рекомендациями ВНИТИП^[1].

Для статистической обработки применяли пакет программ BioStat.

Результаты исследования и обсуждение

Исследованы эмбрионы десяти пород, линий и кроссов кур, характеризующихся высокой (80 % и более — группа 1) и низкой (2…4 % — группа 2) степенью окисления NO в тканях эмбриона. В среднем величина экспрессии большинства генов в эмбрионах мясных и бойцовых форм, отличающихся высокой степенью окисленности оксида азота до нитрата в тканях, была ниже, чем в эмбрионах яичных форм, отличающихся незначительной степенью окисления. По экспрессии фактора миогенной дифференциации 1 (myoD1), фактора миогенеза 5 (myf 5) и миогенина (myog) между этими группами были достоверные различия по критерию Манна — Уитни (табл. 1, 2).

Таблица 1
Экспрессия генов: фактора пролиферации миоцитов 2с (mef 2c), миогенной дифференциации 1 (myoD1), фактора миогенеза 5 (myf 5), миозина (mhy 1), миогенина (myog), соматостатина (MSTN), гонадотропного гормона (GHR) — в ткани грудных мышц куриных эмбрионов различных пород, линий и кроссов на 14‑е сутки инкубации* (n = 7)

Порода, линия, кросс	NO3– / NO, %	Доноры NO+нитрат, мкМ	MSTN	GHR	mef2c	myog	mhy 1	myoD1	myf 5
Группа 1
Мини мясные (линия А77 группа 2)	98,7 ± 1,8	495,5 ± 21,1	–1,5 ± 0,7	–1,3 ± 0,5	–1,6 ± 0,5	0,7 ± 0,4	5,4 ± 0,6	–0,5 ± 0,5	10,1 ± 0,5
CМ56 «Корниш»	97,6 ± 2,7	519,8 ± 17,6	–2,5 ± 0,4	–2,6 ± 0,3	–1,4 ± 0,3	2,0  ±  0,4	4,2 ± 0,5	–1,2 ± 0,5	9,3 ± 0,4
Куланги	95,7 ± 2,5	528,5 ± 17,7	–0,2 ± 0,4	–1,2 ± 0,6	–0,6 ± 0,5	7,2 ± 1,3	13,3 ± 1,1	6,4 ± 0,4	2,0 ± 0,2
Смена 9	97,9 ± 2,6	572,7 ± 18,5	–3,8 ± 0,4	–2,5 ± 0,3	–2,6 ± 0,3	–2,8 ± 0,3	15,8 ± 1,7	–3,4 ± 0,4	3,1 ± 0,3
Брама палевая	80,4 ± 2,9	501,1 ± 17,1	–5,2 ± 1,0	–4,9 ± 0,5	–7,9 ± 2,9	1,1 ± 0,5	0,7 ± 0,5	4,6 ± 0,7	2,9 ± 0,5
Группа 2
Хайсекс белый	1,8 ± 1,0	474,6 ± 16,6	–1,3 ± 0,9	–2,3 ± 0,6	–2,0 ± 1,1	–0,3 ± 0,8	4,7 ± 0,4	–2,1 ± 0,6	5,9 ± 0,6
Плимутрок СМ79	2,9 ± 1,3	461,7 ± 18,2	–2,8 ± 0,5	–2,2 ± 0,7	–2,1 ± 1,3	–6,2 ± 0,8	4,8 ± 0,5	–1,6 ± 1,1	2,4 ± 0,8
Юрловская	3,6 ± 1,9	448,1 ± 15,3	–6,7 ± 0,5	–6,1 ± 1,1	–8,1 ± 0,6	–1,1 ± 0,3	–0,3 ± 0,2	2,9 ± 0,8	–0,3 ± 0,2
Хайсекс браун	2,3 ± 0,8	474,6 ± 16,6	0,4 ± 0,4	–2,6 ± 0,4	–2,7 ± 1,2	–0,8 ± 0,7	0,4 ± 0,3	–4,6 ± 0,7	–0,6 ± 0,4
Орловская	1,9 ± 1,1	444,1 ± 14,2	–1,4 ± 0,8	–1,7 ± 0,4	–1,1 ± 0,8	–2,6 ± 0,7	13,3 ± 2,3	–4,1 ± 0,4	5,1 ± 1,0
								uэксп< uкрит	uэксп< uкрит

*В табл. 1 представлены ∆Ct = Ct — Ct TBP.
Источник: составлено В.Ю. Титовым, И.И. Кочишем, О.В. Мясниковой, А.М. Долгоруковой, М.А. Зайцевой, П.С. Романовым, А.Р. Варданяном.

Таблица 2
Экспрессия генов: фактора пролиферации миоцитов 2с (mef 2c), миогенной дифференциации 1 (myoD1), фактора миогенеза 5 (myf 5), миозина (mhy 1), миогенина (myog), соматостатина (MSTN), гонадотропного гормона (GHR) — в ткани ножных мышц куриных эмбрионов* (n = 7)

Порода, линия, кросс	NO3– / NO,%	Доноры NO+нитрат, мкМ	MSTN	GHR	mef2c	myog	mhy 1	myoD1	myf 5
Группа 1
Мини мясные	97,6  ± 1,8	501,5  ± 18,2	0,4  ± 0,8	0,7  ± 0,2	–2,3  ± 1,8	1,4  ± 1,0	6,8  ± 1,3	0,9  ± 1,2	11,5  ± 1,7
CМ56 Корниш Линия «Смены 9»	95,8  ± 2,9	520,1  ± 16,4	–1,9  ± 0,3	–1,7  ± 0,4	0,7  ± 0,4	12,0  ± 1,7	8,3   ±  2,6	3,4  ± 0,8	13,4  ± 2,1
Куланги	95,2  ± 2,6	528,5  ± 17,7	–1,8  ± 0,9	–2,2  ± 1,8	2,9  ± 1,7	7,0  ± 1,6	14,3  ± 2,0	3,9  ± 0,6	1,4  ± 0,9
«Смена9»	98,1   ± 2,6	561,7  ± 18,7	–2,1  ± 0,4	–1,7  ± 0,5	–1,1  ± 0,8	–2,6  ± 1,4	12,6  ± 2,3	–4,1  ± 1,2	2,8  ± 0,4
Брама	78,5  ± 3,0	495,5  ± 16,6	–3,3  ± 0,5	–3,2  ± 1,4	–7,1  ± 0,9	0,5  ± 0,3	–0,2  ± 0,1	–4,3  ± 0,7	–5,8  ± 0,6
Группа 2
Хайсекс белый	2,4  ± 1,1	442,5  ± 15,8	–0,4  ± 0,2	–0,4  ± 0,1	–1,3  ± 0,5	–0,2  ± 0,1	6,2  ± 0,2	–2,5  ± 0,4	6,7  ± 1,5
Плимутрок СМ79, линия «Смены 9»	3,1  ± 1,8	493,2  ± 17,4	–2,1  ± 0,2	–1,6  ± 0,3	0,0  ± 0,1	–0,4  ± 0,1	6,7  ± 2,2	–3,8  ± 0,5	5,0  ± 0,8
Юрловская	3,8  ± 1,8	434,7  ± 16,1	–5,6  ± 0,6	–4,7  ± 0,6	–9,0  ± 1,4	–0,6  ± 0,2	–1,1  ± 0,8	–4,7  ± 0,4	–7,5  ± 1,4
Хайсекс браун	2,3  ± 1,3	451,6  ± 17,2	–1,0  ± 0,9	–1,2  ± 2,2	0,8  ± 0,2	0,4  ± 1,0	10,1  ± 2,4	–0,4  ± 1,8	2,9  ± 2,3
Орловская	2,3  ± 1,2	428,3  ± 13,1	0,4  ± 0,2	–0,7  ± 0,3	–0,8  ± 0,2	–1,8  ± 0,3	12,4  ± 1,9	–2,5  ± 0,4	4,3  ± 0,8
						uэксп< uкрит

* В табл. 2 представлены ∆Ct = Ct — Ct TBP.
Источник: составлено В.Ю. Титовым, И.И. Кочишем, О.В. Мясниковой, А.М. Долгоруковой, М.А. Зайцевым, П.С. Романовым, А.Р. Варданяном.

Внутри этих групп установлены большие различия в экспрессии генов. Например, экспрессия миостатина варьирует от –1,2 до –6,9 в группе 2 и от –1,6 до –5,4 в группе 1 в грудных мышцах (см. табл. 1). В ножных мышцах различия не меньшие (см. табл. 2). Только по экспрессии фактора миогенной дифференциации 1 (myoD1) и фактора миогенеза 5 (myf 5) в грудных и миогенина (myog) в ножных мышцах между этими группами были достоверные различия по критерию Манна — Уитни.

В связи с этим для установления зависимости между содержанием депонированного NO в тканях и экспрессией исследуемых генов наиболее информативным видится варьирование концентрацией депонированного NO в пределах одной породы, линии и кросса, используя блокаторы синтеза NO и субстрата его синтеза — аргинина.

Нитроаргинин эффективно ингибирует синтез NO, что приводит к снижению содержания метаболитов NO в тканях эмбриона, не изменяя при этом степень окисленности синтезированного NO до нитрата (табл. 3, 4), которая определяется особенностью тканей зародыша [6]. Но эффект Н не постоянен. Введенный перед закладкой на инкубацию, он эффективно ингибирует синтез NO в куриных и перепелиных эмбрионах до 11 суток. Затем его эффект исчезает, но возобновляется после повторного ввода в яйцо [6]. Н — конкурентный ингибитор, конкурирующий с аргинином (А) — субстратом синтеза NO, за NO-синтазу. Введение в яйцо А вместе с Н в концентрации в 10 раз большей, чем Н, полностью снимало ингибирующий эффект последнего (табл. 3, 4).

Как мы установили, А в яйце находится в концентрации насыщения для NO — синтазы [6]. Его ввод в яйцо не приводит к интенсификации синтеза NO, но снимал эффект Н (табл. 3, 4).

Н, введенный до закладки на инкубацию, обеспечивал снижение интенсивности накопления метаболитов NO в эмбрионе к 7 суткам примерно на 70 % (табл. 3, 4). При этом в тканях эмбрионов кур, как и перепелов, имело место снижение экспрессии большинства исследуемых генов, которая не изменялась, если вместе с Н в яйцо вводился аргинин (Н+А). Содержание метаболитов NO в гомогенатах также не изменяется при вводе Н+А. Сам А, введенный в яйцо без Н, не оказывал достоверного воздействия ни на экспрессию генов (табл. 3), ни на содержание метаболитов NO в тканях эмбриона (табл. 3, 4).

Таблица 3
Влияние блокатора синтеза NO нитроаргинина на экспрессию ряда генов в 7- и 14‑суточных эмбрионах кур линии Х2 кросса Хайсекс белый*

Гpуппы	NO3–/NO,%	Доноpы NO+нитpат, мкМ	Экспpессия(ген-­ТВР)
			MSTN	Myf5	Mef2	GHR	Myog	MyoD1	Mhy1
7 суток
К	1,5  ±  0,8	162,2 ± 8,4	–2,45 ± 0,25	–1,12 ± 0,15	–0,21 ± 0,23	–1,85 ± 0,21	0,38 ± 0,07	–1,15 ± 0,18	–2,61 ± 0,24
Н	1,4 ± 1,1	54,8 ± 5,5 p < 0,05	–1,38 ± 0,07 p < 0,05	–0,07 ± 0,04	0,48 ± 0,13 p < 0,05	–1,08 ± 0,26 p < 0,05	0,23 ± 0,06	–0,25 ± 0,06 p < 0,05	–0,58 ± 0,14 p < 0,05
Н+А	1,6 ± 0,9	167,1 ± 8,8	–2,53 ± 0,1	–0,77 ± 0,11	–0,91 ± 0,22	–2,01 ± 0,28	–0,13 ± 0,09	–0,70 ± 0,13	–2,08 ± 0,14
А	1,6 ± 1,0	171,1 ± 9,9	–2,49 ± 0,15	–0,87 ± 0,13	–0,58 ± 0,22	–1,96 ± 0,27	–0,08 ± 0,07	–0,96 ± 0,16	–2,91 ± 0,26
14 суток гpудь
К	2,5 ± 1,2	465,7 ± 10,3	–2,43 ± 0,38	1,31 ± 0,05	–0,03 ± 0,22	–1,85 ± 0,34	–1,02 ± 0,19	–1,83 ± 0,22	–3,72 ± 0,15
Н	2,6 ± 1,2	250,2 ± 9,5 p  <  0,05	–1,18 ± 0,06 p < 0,05	1,67 ± 0,29	0,53 ± 0,17 p < 0,05	–1,01 ± 0,18 p < 0,05	–0,54 ± 0,16 p < 0,05	–0,80 ± 0,20 p < 0,05	–2,93 ± 0,12 p < 0,05
Н+А	2,8 ± 1,5	462,4 ± 11,2	–1,56 ± 0,09	–1,12 ± 0,06	–0,13 ± 0,23	–1,35 ± 0,09	–2,30 ± 0,31	–1,91 ± 0,27	–3,52 ± 0,20
14 суток бедpо
К	2,5 ± 1,2	475,7 ± 10,3	–1,36 ± 0,08	–0,42 ± 0,14	1,37 ± 0,24	0,12 ± 0,1	–1,60 ± 0,26	–0,44 ± 0,27	–2,47 ± 0,44
Н	2,6 ± 1,2	239,2 ± 8,5 p < 0,05	–0,14 ± 0,22 p < 0,05	1,21 ± 0,21 p < 0,05	1,42 ± 0,33	0,57 ± 0,35	–1,05 ± 0,14 p < 0,05	0,01 ± 0,15 p < 0,05	–0,35 ± 0,19 p < 0,05
Н+А	2,8 ± 1,5	452,3 ± 11,2	–1,07 ± 0,18	–0,51 ± 0,30	0,1 ± 0,19	–1,08 ± 0,14	–2,29 ± 0,27	–0,76 ± 0,26	–1,64 ± 0,41

*В яйца группы Н перед закладкой на инкубацию и на 11‑е сутки вводилось 0,3 мл 30 мМ нитроаргинина; в группе Н+А — перед закладкой и на 11‑е сутки — 0,15 мл 60 мМ нитроаргинина + 0,15 мл 600 мМ аргинина; в контрольную (К) в эти же сроки — 0,3 мл стерильного физиологического раствора. В группу А перед закладкой — 0,3 мл 300 мМ аргинина.
Источник: составлено В.Ю. Титовым, И.И. Кочишем, О.В. Мясниковой, А.М. Долгоруковой, М.А. Зайцевым, П.С. Романовым, А.Р. Варданяном.

Из тех генов, на экспрессию которых Н оказывал достоверное влияние по снижению экспрессии, отметим прежде всего миостатин (MSTN). У кур она на 7‑е сутки снижалась более чем в 2 раза (см. табл. 3), у перепелов на 6‑е сутки — в 7 раз (табл. 4). Также экспрессия гонадотропного гормона (GHR) снижалась в 1,3 раза у перепелов и в 2 раза у кур. На экспрессию других генов эффект не везде однозначен. Так на экспрессию фактора миогенеза 5 (myf5) у перепелов не было достоверного эффекта (табл. 4), у кур — на грани достоверности (см. табл. 3). На экспрессию фактора пролиферации миоцитов 2 (mef2) достоверный эффект был у кур — снижение в 1,6–1,7 раза. У перепелов достоверного эффекта не было (табл. 4). На экспрессию миогенина (myog) у кур на 7‑е сутки достоверного эффекта не было. У перепелов достоверное снижение экспрессии в 1,5 раза. На экспрессию фактора миогенной дифференциации 1 (myoD1) достоверный эффект на 7‑е сутки не наблюдался у кур. Экспрессия миозина (mhy 1) у кур достоверно снижалась в 2–4 раза. У перепелов этот ген не представлен (табл. 3, 4).

Н, введенный повторно на 11‑е сутки, на 14‑е сутки вызывал снижение накопления метаболитов NO в тканях эмбриона на 50…60 % (табл. 3, 4). Это сопровождалось изменением экспрессии исследуемых генов, прежде всего, миостатина (MSTN) и гонадотропного гормона (GHR). У кур экспрессия MSTN под действием Н снижалась в 2,3–2,4 раза в ткани грудных и ножных мышц (см. табл. 3), у перепелов в грудных — в 1,17 раза, в ножных — в 1,9 (табл. 4). Экспрессия GHR снижалась у кур в 1,4…1,7 раза, у перепелов в грудных мышцах снижение экспрессии в 1,5 раза, в ножных — в 2,7 раза (табл. 3, 4). Сохранялись и эффекты на другие гены. Заметим, что различия в экспрессии генов между грудными и ножными мышцами в некоторых случаях существенные, несмотря на то что достоверной разницы по содержанию метаболитов NO между ними нет.

Таблица 4
Влияние блокатора синтеза NO нитроаргинина на экспрессию ряда генов в 6- и 13‑суточных эмбрионах перепелов породы японская серая*

Гpуппы	NO3– / NO,%	Доноpы NO+нитpат, мкМ	Экспpессия (ген-­ТВР)
			MSTN	Myf5	Mef2	GHR	Myog	MyoD1
6 суток
К	1,1 ± 0,8	149,3 ± 7,9	–0,61 ± 0,06	2,82 ± 0,06	–1,56 ± 0,08	–0,20 ± 0,08	–0,80 ± 0,30	0,05 ± 0,05
Н	1,2 ± 0,8	28,1 ± 2,1 р < 0,05	2,20 ± 0,80 p < 0,05	2,94 ± 0,10	–1,22 ± 0,09	0,21 ± 0,10 p < 0,05	–0,20 ± 0,05 p < 0,05	0,15 ± 0,10
Н+А	1,1 ± 0,8	150,5 ± 8,1	–1,48 ± 0,18	2,46 ± 0,08	–1,10 ± 0,11	–0,15 ± 0,18	–0,74 ± 0,09	0,21 ± 0,07
13 суток гpудь
К	2,5 ± 1,5	576,6 ± 13,3	0,20 ± 0,16	2,29 ± 0,13	0,21 ± 0,07	0,91 ± 0,12	0,89 ± 0,18	0,66 ± 0,12
Н	2,4 ± 1,2	322,4 ± 11,2 p < 0,05	0,42 ± 0,08	2,39 ± 0,13	0,18 ± 0,07	1,54 ± 0,04 p < 0,05	1,21 ± 0,13	0,91 ± 0,17
13 суток бедpо
К	2,4 ± 1,5	565,4 ± 12,8	–0,43 ± 0,13	2,20 ± 0,13	–0,27 ± 0,07	0,15 ± 0,18	0,21 ± 0,10	0,38 ± 0,06
Н	2,3 ± 1,4	308,1 ± 12,8 p < 0,05	0,48 ± 0,20 p < 0,05	2,71 ± 0,13	0,39 ± 0,17 p < 0,05	1,60 ± 0,24 p < 0,05	1,24 ± 0,14 p < 0,05	1,14 ± 0,09 p < 0,05

*В яйца группы Н перед закладкой на инкубацию и на 11‑е сутки вводилось 0,15 мл 15 мМ нитроаргинина. В группе Н+А — перед закладкой и на 11‑е сутки — 0,15 мл (30 мМ нитроаргинина + 300 мМ аргинина 1:1). В контрольную (К) в эти же сроки — 0,3 мл стерильного физиологического раствора.
Источник: составлено В.Ю. Титовым, И.И. Кочишем, О.В. Мясниковой, А.М. Долгоруковой, М.А. Зайцевым, П.С. Романовым, А.Р. Варданяном.

Ввод Н+А снимал эти эффекты, как снимал и эффект Н по снижению концентрации метаболитов NO (см. табл. 3, 4).

В литературе есть точка зрения, что NO имеет эпигенетический эффект, оказывая влияние на метилирование гистоновых белков, ингибируя ферменты, осуществляющие деметилирование [2]. Есть основание предполагать, что в эмбрионах птиц в качестве регулятора экспрессии выступает механизм окисления NO до нитрата. Исходя из анализа наследования степени окисления NO в эмбрионе, этот процесс определяется как минимум двумя генами [6]. Т.е. наследуются гены, детерминирующие активацию окисления NO.

О том, каков механизм этого окисления можно сказать только то, что накопления нитрита в тканях не происходит [6]. Следовательно, окисление происходит без генерации в окружающую среду активных форм азота. На сегодняшний день мы не знаем способа искусственно снизить интенсивность этого окисления. Но есть способ искусственно его повысить. Это облучение инкубируемых эмбрионов зеленым светом, которое приводит к некоторому увеличению скорости роста [10—12], а также к достоверному увеличению степени окисления эмбрионального NO [6, 7]. Эффекты на экспрессию генов, наблюдаемые нами под действием облучения, были по некоторым генам схожи с наблюдаемыми под действием блокатора NO-синтазы [7]. Мы не рискуем рассматривать облучение зеленым светом как полноценный контроль, поскольку свет может оказывать и другие эффекты, не связанные с NO. Но сопоставление этого эффекта с эффектом нитроаргинина, который блокирует синтез NO, но не влияет на степень его окисления (см. табл. 3, 4), а также со средними величинами экспрессии у яичных и мясных форм (см. табл. 1, 2) дает основание предполагать, что эффект связан с концентрацией соединений-­доноров NO в тканях. К последним относятся, нитрозотиолы (RSNO), динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ), некоторые высокомолекулярные нитраты [5, 13].

Заключение

Таким образом, снижение содержания соединений-­доноров NO приводит к снижению экспрессии большинства исследованных генов, ответственных за миогенез. Отметим снижение экспрессии миостатина, ответственного за подавление роста и дифференциации мышечной ткани. Следовательно, оксид азота в птичьем эмбрионе может играть роль прежде всего регулятора роста мышечной ткани, что важно для быстрорастущих форм, поскольку пролиферация миобластов происходит на эмбриональной стадии развития. Регуляция может осуществляться путем активации механизмов окисления NO до нитрата.

 

 

^{1 Фисинин В.И., Дядичкина Л.Ф., Голдин Ю.С., Позднякова Н.С., Мелехина Т.А., Данилов Р.В., Гупало И.М., Ройтер Л.М., Веденкина И.В., Шинкаренко Л.А., Воронцов А.Н., Босов Д.Ю., Афонин В.В. Технология инкубации яиц сельскохозяйственной птицы : руководство. 3-е изд., переработ. и доп. Сергиев Посад, 2016. EDN: VUZCXN}

Об авторах

Владимир Юрьевич Титов

Московская государственная ветеринарная академия - МВА им. К.И. Скрябина; Федеральный научный центр Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства

Автор, ответственный за переписку.
Email: vtitov43@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2639-7435
SPIN-код: 3912-0315

доктор биологических наук, профессор кафедры радиобиологии и биофизики, Московская государственная ветеринарная академия - МВА им. К.И. Скрябина; главный научный сотрудник, Федеральный научный центр Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства

Российская Федерация, 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23; Российская Федерация, 141311, Московская область, г. Сергиев Посад, ул. Птицеградская, д. 10

Иван Иванович Кочиш

Московская государственная ветеринарная академия - МВА им. К.И. Скрябина

Email: kochish.I@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8892-9858
SPIN-код: 9333-9995

доктор сельскохозяйственных наук, академик РАН, заведующий кафедрой зоогигиены и птицеводства им. А.К. Даниловой

Российская Федерация, 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23

Ольга Вячеславовна Мясникова

Московская государственная ветеринарная академия - МВА им. К.И. Скрябина

Email: omyasnikova71@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9869-0876
SPIN-код: 1466-8393

кандидат сельскохозяйственных наук, доцент кафедры зоогигиены и птицеводства им. А.К. Даниловой

Российская Федерация, 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23

Анна Михайловна Долгорукова

Федеральный научный центр Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства

Email: anna.dolg@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9958-8777
SPIN-код: 7630-3146

кандидат биологических наук, заведующая отделом инкубации

Российская Федерация, 141311, Московская область, г. Сергиев Посад, ул. Птицеградская, д. 10

Мария Александровна Зайцева

Московская государственная ветеринарная академия - МВА им. К.И. Скрябина

Email: may-zay@yandex.ru
студент 3 курса факультета биотехнологии и экологии Российская Федерация, 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23

Петр Сергеевич Романов

Московская государственная ветеринарная академия - МВА им. К.И. Скрябина

Email: romanovpeter1367@yandex.ru
студент 3 курса факультета биотехнологии и экологии Российская Федерация, 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23

Арутюн Робертович Варданян

ЗАО «Научный центр оценки анализа рисков безопасности пищевых продуктов»

Email: harvard3@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0002-1050-8433

кандидат биологических наук, научный сотрудник

Республика Армения, 0071, г. Ереван, Масисское шоссе, д. 107/2

Список литературы