Перспективы штамма 23В78/1 Serratia plymuthica как агента биоконтроля для защиты томата

Полный текст

Введение

Томат — чрезвычайно пластичная культура, выращиваемая повсеместно как в открытом, так и в защищенном грунте. В условиях защищенного грунта томат плодоносит до 265 дней, при этом плоды собирают 1 или 2 раза в неделю [1]. Томаты восприимчивы к болезням, при эпифитотийном развитии которых потери плодов могут достигать 80…90 % [2]. Для получения высоких урожаев качественных плодов необходимо защищать томат от болезней. Однако плоды томата используются в пищу в свежем виде, что накладывает существенные ограничения на применение химических препаратов, прежде всего из-за длительного периода ожидания. В исследовании инсектицидов и фунгицидов, применяемых для защиты томата, показано, что остаточное количество этих веществ присутствует в плодах в достаточно высокой концентрации в течение 6…8 дней после обработки [3].

Возможным решением проблемы может быть применение биологических препаратов, для которых период ожидания отсутствует или не превышает 7 суток. В этих препаратах используются живые организмы или природные биологически активные соединения, вырабатываемые организмами. Биологические препараты более экологичны, не накапливаются в окружающей среде. В каталоге пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации ^[1], для защиты томата от болезней зарегистрированы препараты Bacillus subtilis, B. amyloliquefaciens, Pseudomonas asplenii, P. aureofaciens, Lactobacillus plantarum, Trichoderma harzianum, T. reesei, T. asperellum, T. atroviride, T. longibrachiatum, T. viride. Однако препараты, содержащие эти микроорганизмы в живом виде или продукты их жизнедеятельности, недостаточно эффективны против всего комплекса болезней томата. Необходимо искать новые штаммы микроорганизмов. Большой интерес в качестве потенциальных агентов биоконтроля вызывают бактерии, относящиеся к роду Serratia. В России не зарегистрировано ни одного препарата на основе этих бактерий. За рубежом бактерии этого рода считаются перспективными для применения в качестве агентов биоконтроля. Показано, что S. ureilytica штамм ILBB 145 хорошо защищает растения томата от питиозной гнили [4]. Опыты со штаммом ETR1 S. marcescens показали хорошие результаты для защиты растений чая [5]. S. marcescens (штамм с8) в лабораторных условиях показала ингибирующий эффект на рост фитопатогенных грибов [6]. Штамм MM S. plymuthica проявил высокую степень антагонизма по отношению к Fusarium oxysporum, выделенному из арбуза [7]. Выявлен и иммуностимулирующий эффект: обработка растений томата препаратом на основе штамма C2 Serratia sp. повышала устойчивость к вирусу PVY и осмотическому стрессу [8].

Мы исследовали антагонистическую активность и фитотоксичность штамма 23В78/1 Serratia plymuthica с целью оценки его использования в качестве биофунгицида для контроля грибных болезней томата.

Материалы и методы исследования

Штамм Serratia plymuthica был выделен из мицелия гриба Aspergillus ochraceus (штамм 23TaPT78), изолированного из клубня картофеля, выращенного в Таджикистане. Видовую принадлежность бактерии определяли с помощью секвенирования универсальной видоспецифичной последовательности гена 16S рибосомной РНК по праймерам (27f/1492r 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3′/5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA‑3′) [9].

Биохимический профиль исследовали с помощью набора реагентов № 1 «Системы индикаторные бумажные для идентификации микроорганизмов» (АО «НПО» «Микроген»). Бактерии протестировали in vitro на антагонистическую активность против 11 фитопатогенов (табл. 1) методом двой­ной культуры, как описано в [10] с небольшими изменениями. В чашку Петри с картофельно-­глюкозным агаром (КГА) помещали агаровый блок (5 × 5 мм) с мицелием гриба. На расстоянии 20 мм от агарового блока штрихом наносили бактерии (рис. 1). Для контроля штаммы грибов высаживали в центр свободной чашки Петри, которую инкубировали при тех же условиях, что и чашки с попарным сращиванием. Инкубировали чашки в темноте при 25 °С в течение 7 суток, после чего оценивали рост колонии гриба. Антагонистическую активность оценивали по ширине зоны ингибирования роста мицелия между колонией гриба и бактерией. Все эксперименты проводили в 3 повторностях. Для тестирования антагонистической активности использовали чистые культуры грибов из коллекции РУДН: Alternaria solani s. l., Botrytis cinerea Pers., Colletotrichum truncatum (Schwein.) Andrus & W.D. Moore, Fusarium citri M.M. Wang, Qian Chen & L. Cai, F. incarnatum (Desm.) Sacc., F. duofalcatisporum J.W. Xia, L. Lombard, Sand.-Den., X.G. Zhang & Crous, F. incarnatum (Desm.) Sacc., F. oxysporum Schltdl., Globisporangium ultimum (Trow) Uzuhashi, Tojo & Kakish. (=Pythium ultimum), Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary (табл. 1).

Таблица 1
Штаммы грибов, использованные в работе

Штамм	Вид	Источник выделения штамма	Место сбора образца
23MLTF87	Alternaria solani	Плод томата	Мали
T129_22MOVTL2	Botrytis cinerea	Плод томата	Московская область, Россия
23MLTF62	Colletotrichum truncatum	Плод томата	Мали
20UgTF2	Fusarium citri	Плод томата	Уганда
20UgTF3	F. incarnatum	Плод томата	Уганда
20UgLaTF7	F citri	Плод томата	Уганда
23MLTF61	F. duofalcatisporum	Плод томата	Мали
23MLTF88A	F. incarnatum	Плод томата	Мали
20UgLaTF4	F. oxysporum	Плод томата	Уганда
Pyth	Globisporangium ultimum	Клубень картофеля	Минская область,  Белоруссия
21KTOP2	Sclerotinia sclerotiorum	Стебель топинамбура	Костромская область, Россия

Источник: составлено В.А. Платоновым, М.Б.Э. Нжойа, А.С. Еланским,  Д.Н. Скоковым, С.Н. Еланским, Е.М. Чудиновой.

Перспективным применением биопрепаратов на основе тестируемой бактерии Serratia plymuthica считаем предпосадочную обработку семян, поэтому оценку фитотоксичности проводили на прорастающих семенах томата сорта «Спелый банан». Семена томата помещали в чашку Петри на фильтровальную бумагу, смоченную 10 мл суспензии бактерий в концентрации 10³, 10⁵ и 10⁷ КОЕ/мл. Для контроля использовали стерильную воду. Инкубировали чашки при фотопериодизме 16/8 день/ночь при 25 °С в течение 7 суток, после чего замеряли длину корня и ростка.

Расчет доверительного интервала среднего µ производили следующим образом:

${\bar{X} - t \frac{s}{\sqrt{n}} \le \mu \le \bar{X} + t \frac{s}{\sqrt{n}} }$,

где X — среднее значение; S — стандартное отклонение; n — число наблюдений; t — константа t-теста для уровня значимости 0,05. Все расчеты проводились в программе Excel 2010.

Результаты исследования и обсуждение

Из мицелия разных фитопатогенных грибов было выделено 10 штаммов бактерий разных видов. Они были протестированы на антагонистическую активность на 4 штаммах грибов видов A. solani, C. truncatum, F. citri, F. oxysporum (см. табл. 1). Штамм 23В78/1 был единственным, который оказал ингибирующее действие на рост всех тестируемых грибов, в связи с чем он был отобран для дальнейших исследований.

Определение видовой принадлежности штамма 23В78/1 по последовательности гена 16S (NCBI PQ675617) показало, что он 100 % идентичен штаммам С1 (CP053398), SWSY‑3.47 (AP035790), 3Re4–18 (CP01209) Serratia plymuthica.

Для подтверждения видового диагноза был проведен анализ биохимического профиля штамма. По биохимическому профилю наш штамм полностью соответствовал виду S. plymuthica (табл. 2) [11]. По результатам обоих проведенных тестов было решено отнести изолят 23В78/1 к виду S. plymuthica.

Таблица 2
Биохимические свой­ства штамма 23В78/1

Соединение	Сахароза	Глюкоза	Мальтоза	Лактоза	Манноза	Инозит	Маннит	Образование индола
Биохимическая реакция	+	+	+	+	+	+	+	–

Фермент	Уреаза	Орнитин  декарбоксилаза	Лизин  декарбоксилаза	Аргинин  дегидролаза	Оксидаза
Биохимическая реакция	–	–	–	–	–

Источник: составлено В.А. Платоновым, М.Б.Э. Нжойа, А.С. Еланским,  Д.Н. Скоковым, С.Н. Еланским, Е.М. Чудиновой.

Оценка антагонистической активности была повторно проведена на более широком наборе штаммов фитопатогенных грибов, включающем кроме ранее тестированных A. solani, C. truncatum, F. citri, F. oxysporum еще и B. cinerea, F. incarnatum, F. duofalcatisporum, F. incarnatum, S. sclerotiorum и оомицет G. ultimum. Штамм 23В78/1 успешно сдерживал рост всех анализируемых фитопатогенных грибов (табл. 3). Самое эффективное влияние штамм оказывал на B. cinerea, мицелий которого рос строго в противоположную сторону от бактерии, поэтому расстояние от колонии гриба до бактерии было максимально возможным (рис. 1, 2). Также отмечено сильное влияние на рост A. solani, C. truncatum, F. oxysporum. Контрольный тест на рост мицелия грибов в чашке без бактерий показал быстрый рост большинства штаммов. Колонии F. citri, F. oxysporum, G. ultimum, S. sclerotiorum заняли всю поверхность агаризованной среды. Botrytis cinerea, F. incarnatum, F. duofalcatisporum, F. incarnatum также заняли почти всю площадь чашки. Alternaria solani и Colletotrichum truncatum росли несколько медленнее (табл. 3).

Таблица 3
Влияние штамма 23В78/1 на рост фитопатогенных грибов

Видовое название	Название штамма	Название болезни, вызываемое патогеном	Ширина зоны ингибирования роста мицелия, мм	Диаметр колонии в контроле, мм
Alternaria solani	23MLTF87	Альтернариоз  (пятнистость) листьев, сухая гниль плодов	5*	55*
Botrytis cinerea	22MOVTL2	Серая гниль плодов и др. органов	20	68
Colletotrichum truncatum	23MLTF62	Антракноз  (язвы на плодах, стебле, пятна на листьях)	4	58
Fusarium citri	20UgTF2	Сухая гниль плодов, увядание	5	80
F. incarnatum	20UgTF3		4	71
F citri	20UgLaTF7		5	80
F. duofalcatisporum	23MLTF61		2	75
F. incarnatum	23MLTF88A		3	70
F. oxysporum	20UgLaTF4	Увядание, гниль корней	5	80
Globisporangium ultimum	Pyth	Гниль корней	3	80
Sclerotinia sclerotiorum	21KTOP2	Белая гниль плодов  и стеблей	7	80

Примечание. * — среднее из 3 измерений. Усреднено до целого.
Источник: составлено В.А. Платоновым, М.Б.Э. Нжойа, А.С. Еланским,  Д.Н. Скоковым, С.Н. Еланским, Е.М. Чудиновой.

Рис. 1. Оценка антагонистической активности штамма 78/1: 1 — Alternaria solani; 2 — Botrytis cinereal; 3 — Pythium ultimum; 4 — Colletotrichum truncatum; 5 — Fusarium citri (20UgLaTF7); 6 — Fusarium oxysporum
Источник: выполнено Е.М. Чудиновой.

Оценка фитотоксичности на семенах томата показала, что присутствие бактерий в разной концентрации не угнетает прорастание и рост семян томата. Как видно на рис. 1, длина корней и побегов приблизительно одинакова и не имеет статистически достоверных отличий как в контрольном варианте, так и в присутствии бактерий, даже при их достаточно высокой концентрации (10⁷ КОЕ/мл) (см. рис. 1).

Рис. 2. Длина побега и корня томата, мм, на седьмой день после посева семян в присутствии суспензии бактерий штамма 78/1 концентрации 103, 105 и 107 КОЕ/мл и без бактерий (контроль). Планки погрешностей показывают доверительный интервал среднего при уровне значимости 0,95
Источник: составлено В.А. Платоновым, М.Б.Э. Нжойа, А.С. Еланским, Д.Н. Скоковым, С.Н. Еланским, Е.М. Чудиновой.

Представителей рода Serratia все чаще рассматривают как агентов биоконтроля и как ростостимулирующие организмы [12]. Отмечается, что они могут синтезировать гормоны растений, фитосидерофоры, помогающие усваивать минеральные элементы растениям, продуцировать вторичные метаболиты, угнетающие рост грибов, насекомых и фитопатогенных бактерий [13–15]. В дальнейшей работе мы планируем проверить эффективность штамма 23В78/1 на растениях в закрытом грунте и на полевых делянках.

Заключение

Штамм Serratia plymuthica 23В78/1 показал антагонистическую активность в отношении возбудителей значимых заболеваний томата в тестах in vitro и не оказывал негативного влияния на прорастание семян томата и молодых растений, что позволяет рассматривать этот штамм как потенциальный агент контроля грибных болезней томата. Поиск новых штаммов для защиты растений позволит сделать сельское хозяйство менее зависимым от применения химических средств защиты, повысит экологичность производства растительной продукции.

 

^{1 Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации», издание от 2 декабря 2024 г. URL: https://mcx.gov.ru/ministry/departments/departament-­rastenievodstva-mekhanizatsii-­khimizatsii-i-zashchity-­rasteniy/industry-­information/info-gosudarstvennaya-­usluga-po-gosudarstvennoy-­registratsii-pestitsidov-i-agrokhimikatov/ (дата обращения: 04.12.2024).}

Об авторах

Владислав Андреевич Платонов

Российский университет дружбы народов

Email: vlad97p@gmail.com
ORCID iD: 0009-0008-9719-5815

аспирант агробиотехнологического департамента аграрно-технологического института

Российская Федерация, 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8

Мбум Белниссе Эрика Нжойа

Российский университет дружбы народов

Email: 1032215646@pfur.ru
ORCID iD: 0009-0008-4650-0971

студент агробиотехнологического департамента аграрно-технологического института

Российская Федерация, 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8

Александр Сергеевич Еланский

Российский университет дружбы народов

Email: sasha.elansky@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-7485-7654

аспирант агробиотехнологического департамента аграрно-технологического института

Российская Федерация, 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8

Денис Николаевич Скоков

Российский университет дружбы народов

Email: 1132236262@pfur.ru
ORCID iD: 0009-0006-4851-3747

студент агробиотехнологического департамента аграрно-технологического института

Российская Федерация, 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8

Сергей Николаевич Еланский

Российский университет дружбы народов; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: elanskiy_sn@pfur.ru
ORCID iD: 0000-0003-1697-1576
SPIN-код: 6827-8026

доктор биологических наук, доцент, ведущий научный сотрудник биологического факультета, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; профессор агробиотехнологического департамента аграрно-технологического института, Российский университет дружбы народов

Российская Федерация, 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8; Российская Федерация, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12

Елена Михайловна Чудинова

Российский университет дружбы народов

Автор, ответственный за переписку.
Email: chudinova_em@pfur.ru
ORCID iD: 0000-0003-3157-494X
SPIN-код: 6688-8116

кандидат биологических наук, доцент агробиотехнологического департамента аграрно-технологического института

Российская Федерация, 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8

Список литературы

Дополнительные файлы