Antimicrobial resistance of bovine mastitis pathogens

Grigory M. Firsov; Фирсов Григорий Михайлович; Aleksey A. Ryadnov; Ряднов Алексей Анатольевич; Tamara A. Ryadnova; Ряднова Тамара Александровна; Zoya C. Morozova; Морозова Зоя Черменовна; Oleg V. Budtuev; Будтуев Олег Валерьевич

doi:10.22363/2312-797X-2024-19-1-51-60

Antimicrobial resistance of bovine mastitis pathogens

Authors: Firsov G.M.¹, Ryadnov A.A.¹, Ryadnova T.A.¹, Morozova Z.C.¹, Budtuev O.V.¹
Affiliations:
1. Volgograd State Agrarian University
Issue: Vol 19, No 1 (2024): Factors of sustainable animal productivity: from genomics to therapy
Pages: 51-60
Section: Factors of sustainable animal productivity: from genomics to therapy
URL: https://agrojournal.rudn.ru/agronomy/article/view/19990
DOI: https://doi.org/10.22363/2312-797X-2024-19-1-51-60
EDN: https://elibrary.ru/AMXNZZ

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Inflammation of mammary gland - mastitis - can be caused by various reasons, both physical and microbiological. Mastitis affects physical and technological quality of milk, growth of economic costs and increase in milk production cost, especially due to the use of antimicrobial drugs. The purpose of the research was to study antibacterial resistance of mastitis pathogens in cattle. The studies were carried out in the Oktyabrsky and Kamyshinsky districts, Volgograd region in 2019-2023. 1206 milk samples from Holstein- Friesian cows aged 4-7 years were examined using standard microbiological methods. Antimicrobial susceptibility testing was performed on Mueller - Hinton agar using a modified Kirby - Bauer disc diffusion method. Based on the results of microbiological studies, microbial growth of 984 cultures ( S. aureus , Str. agalactiae , Str. uberis , E. coli , Klebsiella spp. , Pseudomonas aeruginosa , Pasteurella multocida , Trueperella pyogenes and Mycoplasma spp. ) was identified . In the study, multiple resistance to the studied antimicrobial drugs was noted, for example, E. coli had resistance to all 9 drugs; Pseudomonas aeruginosa - to 8; Mycoplasma spp. - to 7; S. aureus , Str. agalactiae , Str. uberis , Klebsiella spp . and Pasteurella multocida - to 6; Trueperella pyogenes to 1 drug. Constant monitoring of resistance of bovine mastitis pathogens to antimicrobial agents contributes to a more effective selection of therapy for clinical mastitis.

Keywords

Holstein-Friesian breed, quantitative distribution, cow, economic damage, therapy of clinical mastitis

Full Text

Введение

Мастит — воспаление вымени (молочной железы) под влиянием различных причин воздействия как физического, так и микробиологического характера [1–7]. Мастит влияет на количество производимого молока, его физическое и технологическое качество, что приводит к существенному росту экономических затрат и снижает экономическую эффективность производства. Заболевание маститом часто встречается в молочном животноводстве во всем мире, его терапия является самой дорогостоящей и наиболее финансово затратной в большей степени по причине широкого использования противомикробных препаратов [1–7].

К патогенным возбудителям мастита относят патогенные стафилококки (например S. aureus), патогенные стрептококки (такие, как Str. agalactiae) и микоплазмы (Mycoplasma spp.), однако такие как кишечная палочка (E. coli), стрептококки (S. dysgalactiae, Str. pyogenes, Str. uberis), клебсиеллы (Klebsiella spp.), псевдомона (Pseudomonas aeruginosa) и гноеродные факультативные анаэробные бактерии Trueperella pyogenes являются условно-патогенными [8].

Использование антимикробных препаратов, в частно сти антибиотиков — наиболее широко используемый метод терапии маститов и снижения их распространения у коров. Но тяжелым побочным эффектом несоблюдения правил использования антибиотиков при лечении инфекций (в т. ч. маститов) является приобретение микроорганизмами устойчивости к этим препаратам. Особенно актуально это при широком неконтролируемом применении антибиотиков, в частности без микробиологического контроля чувствительности возбудителей [1–12]. Исследования антимикробной чувствительности возбудителей мастита для контроля за заболеванием необходимы и чрезвычайно актуальны. Возникновение устойчивости возбудителей, вызывающих маститы у крупного рогатого скота (КРС), негативно сказывается на контроле эффективности терапии этого заболевания, т. е. исследование устойчивости к противомикробным препаратам (УПП) непосредственно влияет на эффективность проводимой терапии. Нужно учитывать, что уровни проявления антимикробной устойчивости изменяются со временем, переоцениваются практически ежегодно для актуализации информации об изменении уровней УПП [7].

Цель исследования — изучение антибактериальной резистентности микроорганизмов, выделенных из секрета вымени коров.

Материалы и методы исследования

Исследования проводили в Октябрьском и Камышинском районах Волгоградской области с 2019 по 2023 гг. За этот период обследовали 1206 образцов молока на наличие в нем возбудителей мастита с их идентификацией до родов и видов. Все пробы получили от коров голштино-фризской породы возраста 4–7 лет. У всех коров предварительно был поставлен диагноз «клинический мастит» по результатам клинического и лабораторного исследований. До момента забора проб животным не проводили терапию антимикробными препаратами. Все отобранные образцы помещали в стерильные пробирки и по холодовой цепи направляли в лабораторию кафедры для дальнейшего исследования.

Все отобранные пробы исследовали стандартными микробиологическими методами. Для исследования бактериальных культур отбирали образец объемом 50 мкл, который наносили штрихами в стерильные полимерные чашки Петри с Колумбийским агаром, агаром МакКонки («Биомедиа», Россия) и агаром Левина с метиленовым синим и эозином (НПО «Питательные среды», Россия). Чашки распределили на серии, одну подвергали инкубации при аэробных условиях, другую в анаэробной станции YY-M (Китай) в атмосфере 10 % СО₂ при 37 °C 48–72 часа. Для идентификации грампозитивных и грамнегативных бактерий и дрожжей использовали наборы RapID™ (BioVitrum, Россия) и API® (ООО «биоМерье Рус», Россия).

Стрептококки (Streptococcus spp.) и коринебактерии (Corynebacterium spp.) идентифицировали по их морфологическим характеристикам, тинкториальным свой-ствам при окраске по Граму, исследованием при прямой световой микроскопии с использованием микроскопа Биоптик C-400 (Биомед, Россия) и по их ферментационным (биохимическим) свой-ствам.

Микоплазм выделяли на агаре PPLO (HiMedia Laboratories, Индия), на котором производили посев по 50 мкл проб молока и проводили анаэробную инкубацию при 37 °C в атмосфере с 10 % CO₂ в течение недели. Идентификацию до рода микроорганизмов проводили, изучая на чашках характер колоний с помощью стереомикроскопа Olympus-SZ61 (Япония).

Для анализа на чувствительность к противомикробным препаратам использовали агар Мюллера — Хинтона («Биомедиа», Россия) в модифицированном дискодиффузном методе Кирби — Бауэра [13, 14].

Для проведения тестов использовали картриджи с тест-дисками противомикробных препаратов Bioanalyse (Турция). В тестировании испытали тест-диски со следующими антимикробными препаратами: пенициллины — ампициллин, пенициллин, пенициллины в комбинациях — амоксициллин+клавулановая кислота (амоксиклав), тетрациклины — тетрациклин, окситетрациклин, аминогликозиды — гентамицин, цефалоспорины — цефалексин, цефтиофур, комбинированные сульфаниламиды — ко-тримоксазол (сульфаметоксазол+триметоприм). В качестве контроля за исследованием in vitro применяли микробные штаммы эталонных культур E. coli (ATCC 25922) и S. aureus (ATCC 25923).

Для статистического анализа данных использовали программу Biostat LE for Excel® (AnalistSoft, Россия).

Результаты исследования и обсуждение

Независимо от формы течения болезни (клинической или субклинической) мастит у коров наносит большой экономический ущерб. Это сложное и в большинстве своем инфекционной природы заболевание вымени у КРС, ведущее к снижению качества молока и надоев. С учетом спроса на молоко в мире и вопросов импортозамещения продовольственных товаров экономический ущерб может быть значительным. Например, М.В. Корнелаева, Г.Г. Карликова отмечают большее влияние мастита на уровень удоя коров, нежели влияние других заболеваний [14]. N. Wang и др. указывают на огромный экономический ущерб от мастита [15]. Для адекватности ведения терапевтического воздействия необходимо выбирать соответствующий противомикробный препарат для контроля за заболеванием и предотвращения дальнейшего развития микробной устойчивости возбудителей мастита у коров. Были изучены свой-ства штаммов возбудителей бактериальной природы, выделенных из проб молока коров с установленным диагнозом «клинический мастит».

К получению отрицательных результатов бактериологического исследования могут приводить факторы низкой концентрации микроорганизмов, недостаточный уровень квалификации при выполнении лабораторного исследования, недостаточное время экспозиции микробиологических проб и т. д. Согласно С.А. Макавчик на ложно негативные результаты бактериологического исследования может оказывать влияние бактериостатическая и бактериолитическая активность молока или молозива за счет биологически активных компонентов (лизоцим, лейкоциты и др.) [16]. Инфицирование бактериями происходит не всегда. Многие авторы утверждают, что причинами мастита могут быть вирусы, грибки, дрожжи [10, 11]. Как отмечают О.Т. Экхорутомвен, Г.Ф. Медведев мастит у коров может быть ответом на факторы травматического или токсического происхождения [4]. Мы не наблюдали роста микробных культур в 222 пробах из 1206 обследованных, что составило 18,41 %. Турецкие исследователи O. Ardicli, S.K. Demirbilek, K.T. Carli показали сопоставимые результаты — 18,36 % [9]. Количественное распределение выделенных микроорганизмов по годам отображено на рис. 1.

Рис. 1. Количественное распределение выделенных микроорганизмов по годам
Источник: сделано авторами
Fig. 1. Quantitative distribution of isolated microorganisms by years
Source: created by the authors

В результате проведенных микробиологических исследований установлен микробный рост и дифференцированы 984 культуры, из которых основную массу составили S. aureus и E. coli по 268 (22,22 %) и 258 (21,39 %) изолятов соответственно. Не менее значимые показатели были получены и для стрептококков Str. agalactiae — 167 (13,85 %) и Str. uberis — 113 (9,37 %). Распределение других возбудителей маститов КРС было следующим.

Из условно патогенных микроорганизмов свою долю заняли Pseudomonas aeruginosa 77 (6,38 %), Pasteurella multocida 34 (2,82 %), Trueperella pyogenes 34 (2,82 %) и Klebsiella spp. 12 (1 %). Представители рода микоплазм Mycoplasma spp. были зарегистрированы в 21 случае (1,74 %). Все эти возбудители встречались в форме моноинфекций — 22 % и смешанных инфекций — 78 %. Особенно это было характерно для стрептококков Str. agalactiae и Str. uberis. Однако, П.А. Руденко, А.А. Руденко, Ю.А. Ватников отмечают наличие микробных ассоциаций среди возбудителей мастита у коров от 2 до 7 возбудителей [17]. Количественное распределение устойчивых изолятов за пятилетний период показано на рис. 2. Необходимо отметить, что количество выделенных проб E. coli уменьшилось с 57 в 2020 г. до 50 в 2023 г., т. е. на 12,28 %, S. aureus с 54 в 2020 г. до 51 в 2022 г. соответственно на 5,88 %. Аналогичное снижение количества положительных результатов отмечается и у Klebsiella spp. с 4 в 2019 г. и до 1 в 2023 г., хотя тенденция более выражена и достигает 400 %. У Mycoplasma spp. эти показатели отмечаются на уровне 5 в 2019 и 2021 гг., снижаясь до 3 в 2023 г., соответственно на 60 %. Было бы справедливо отметить, что на этих возбудителей оказывают воздействие как факторы внешней среды (характер содержания, особенности соблюдения гигиены, практика доения, особенности профилактических мероприятий и т. д.), так и состояние внутренней среды организма коров (защитные факторы иммунитета, гормональный фон и т. д.). Это отмечается как российскими исследованиями [7, 10], так и зарубежными [8, 9].

Рис. 2. Количественное распределение устойчивых изолятов выделенных микроорганизмов (за 5 лет)
Источник: сделано авторами
Fig. 2. Quantitative distribution of resistant isolates of the microorganisms (for 5 years)
Source: created by the authors

Необходимо подчеркнуть, что исследование УПП возбудителей помимо их выделения и идентификации — основа противомикробной терапии при клинических маститах, что позволяет выбрать адекватные и доступные средства терапии клинического мастита.

При проведении исследований устойчивости к противомикробным препаратам было выявлено 100 % устойчивости E. coli к препаратам ампициллин и цефтиофур, Pseudomonas aeruginosa — к ампициллину, пенициллину, амоксиклаву, цефалексину и цефтиофуру, Pasteurella multocida — ампициллину и цефтиофуру, Mycoplasma spp. — ампициллину, пенициллину, амоксиклаву, гентамицину, цефалексину, цефтиофуру и тримоксазолу, Str. uberis к тетрациклину и S. aureus к пенициллину. Устойчивость к противомикробным препаратам более чем у 40 % штаммов установлено у S. aureus к тетрациклину (46,64 %) и окситетрациклину (40,3 %), Str. agalactiae к тетрациклину (71,86 %) и окситетрациклину (40,31 %), Str. uberis к окситетрациклину (70,8 %), ампициллину (42,48 %), пенициллину (46,02 %), цефтиофуру (45,13 %) и гентамицину (44,25 %). E. coli показала высокую устойчивость к тетрациклину (96,9 %), цефалексину (83,33 %), пенициллину (48,45 %), окситетрациклину (48,06 %) и гентамицину (39,53 %), Pseudomonas aeruginosa (74,03 %) к тримоксазолу, Pasteurella multocida к пенициллину и тримоксазолу (по 50 %) и амоксиклаву (47,6 %), Trueperella pyogenes (50 %) к амоксиклаву. Кроме того, наблюдалась умеренная устойчивость S. aureus к ампициллину (34,7 %), гентамицину (20,52 %), цефтиофуру (2,24 %), Str. agalactiae к пенициллину (34,13 %), цефтиофуру (32,34 %), ампициллину (29,94 %), гентамицину (26,95 %), E. coli к гентамицину (39,53 %) и тримоксазолу (18,6 %).

В ходе исследования мы отметили множественную устойчивость к изучаемым антимикробным препаратам, так у E. coli ко всем 9, Pseudomonas aeruginosa к 8, Mycoplasma spp. к 7, S. aureus, Str. agalactiae, Str. uberis, Klebsiella spp., Pasteurella multocida к 6, Trueperella pyogenes к одному препарату. О. Ardicli, S.K. Demirbilek, K.T. Carli отмечают похожие результаты при исследовании микробной чувствительности с 10 антимикробными препаратами [9]. Благодаря результатам исследований можно констатировать: устойчивость к антимикробным препаратам является значительной проблемой при терапии клинического мастита у коров. Наибольшую роль, по нашему мнению, играет не антимикробная резистентность к конкретным препаратам, а их доступность и относительная дешевизна в ветеринарной практике.

Заключение

Мы провели микробиологическое исследование на наличие возбудителей клинического мастита у коров и определение их устойчивости к противомикробным препаратам. Наиболее часто выделялись грам-негативные кокки — S. aureus, Str. agalactiae, Str. uberis и грам-негативные палочки — E. coli, Pseudomonas aeruginosa. Менее часто встречались грам-негативная Pasteurella multocida и Klebsiella spp. и грам-позитивная Trueperella pyogenes. Также были выделены культуры Mycoplasma spp., S. aureus по нашим наблюдениям проявил высокую устойчивость к тетрациклинам. E. coli проявила лекарственную устойчивость к тетрациклинам (тетрациклин) и цефалоспоринам (цефалексин, цефтиофур). Вызывает тревогу повышение лекарственной устойчивости, особенно к препаратам, широко используемым и рекомендуемым при лечении клинических маститов. Таким образом, постоянный мониторинг устойчивости к противомикробным препаратам возбудителей маститов КРС способствует более эффективному подбору терапии клинических маститов.

About the authors

Grigory M. Firsov

Volgograd State Agrarian University

Author for correspondence.
Email: firsovgm@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1262-6532
SPIN-code: 8781-7218

Candidate of Veterinary Sciences, Associate Professor, Department of Veterinary and Sanitary Expertise, Infectious Diseases and Morphology