Разработка новых иммуноаналитических тестсистем для диагностики черной ножки картофеля, вызываемой бактериями Dickeya spp

Полный текст

Введение

Черная ножка картофеля, вызываемая бактериями Dickeya spp., — одно из опаснейших и агрессивно развивающихся заболеваний картофеля [1]. Данная болезнь может приводить к задержке роста, увяданию, хлорозу листьев, некрозу нескольких тканей, снижению урожайности, а иногда и к гибели растений [2]. Заболевание обнаружено на территории РФ сравнительно недавно, первые упоминания относятся к 2009 г. [3]. Однако уже к 2013 г. на Dickeya spp. приходилось до 28 % зараженного семенного материала при ПЦР тестировании [4] и до 24 % — при скрининге иммуноферментными системами [5]. Существует несколько факторов, которые вызывают рост распространенности болезней картофеля данной этиологии [6–8]. Прежде всего это климатический фактор — повышение температуры как следствие глобального потепления положительно влияет на рост и развитие бактерий Dickeya  spp. Вторым фактором является популяционная устойчивость бактерий Dickeya spp. относительно других видов патогенов. Так, при анализе часто выявляются смешанные инфекции, включающие Dickeya spp. как один из компонентов комплексного бактериоза. И третий важнейший фактор — способность бактерий Dickeya spp. долгое время находиться в виде латентной инфекции, проявляясь лишь в определенных агроклиматических условиях. Скрытое инфицирование семенного картофеля является частой причиной распространения черной ножки во всем мире [9]. Таким образом, черная ножка картофеля, вызываемая бактериями Dickeya spp., является значительной угрозой для производства картофеля на территории РФ.

На сегодняшний день выбраковка зараженных растений на ранних этапах болезни — наиболее эффективный способ предотвратить или минимизировать урон от черной ножки. Для этого необходим постоянный мониторинг инфицирования семенного материала. Среди диагностических инструментов, решающих эту задачу, выделяют две группы методов. Первая группа основана на распознавании и дальнейшей амплификации ДНК фрагмента бактерии. Это прежде всего ПЦР-методы, описанные в [10] и представленные зарубежными и отечественными компаниями в виде коммерчески доступных тест-систем. Высокая чувствительность — основное преимущество ПЦР-методов, но их ограничение — строгие требования к лабораторному оборудованию и условиям проведения анализа. Вторую группу составляют иммунохимические методы, основанные на распознавании антигенных детерминант на поверхности бактериальных клеток. В этой категории наиболее распространенными и коммерчески доступными являются иммуноферментный анализ (ИФА) и иммунохроматографический анализ (ИХА). В обоих случаях распознавание бактерии происходит благодаря специфическим антителам, которые взаимодействуют с бактерией или фрагментами, содержащими ее антигенные детерминанты (полисахариды, белки). Как правило, чувствительность иммуноаналитических методов уступает ПЦР диагностике, но минимальный набор оборудования для ИФА — всего лишь термостат, холодильник и набор автоматических пипеток. Для ИХА оборудование не требуется, весь анализ занимает 10…15 минут и может быть проведен в полевых условиях. Для детекции Dickeya spp. доступны коммерческие ИФА наборы зарубежных производителей Loewe и Agdia и ИФА набор, производимый Федеральным исследовательским центром картофеля им. А.Г. Лорха (ФИЦ картофеля им. А.Г. Лорха). Среди коммерчески доступных иммунохроматографических тест-полосок доминируют те же зарубежные компании; имеется единственный отечественный производитель (www.тест-картофель.рф), работающий в тесном научном сотрудничестве с ФИЦ Биотехнологии РАН и ФИЦ картофеля им. А.Г. Лорха. На сегодняшний день производство отечественных иммуноаналитических тест-систем по объемам уступает зарубежным конкурентам, что не позволяет проводить мониторинг инфицирования на регулярной основе на всех этапах производства картофеля. Одним из препятствий на пути к разработке новых иммунодиагностических систем является ограниченность иммунореагентов. Расширение иммунореагентной базы за счет появления новых специфичных антител будет способствовать разработке новых иммуноаналитических тест-систем.

Основная цель исследования — получение новых поликлональных антител, специфичных к Dickeya spp., и разработка на их основе иммуноаналитических тест-систем (ИФА, ИХА).

Материалы и методы исследования

Бактериальные изоляты. D. solani (DSM 28711), D. dianthicola (DSM 18054), D. zea (DSM 18068), D. dadantii subsp. dadantii (DSM 18020), D. paradisiaca (DSM 18069), D. fangzhongdai (DSM 101947), D. chrysanthemi (DSM 4610), Pectobacterium atrosepticum (DSM 18077) и P. carotovorum subsp. carotovorum (DSM 30168) получены из Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ, Германия), хранение и культивирование полученных изолятов на территории РФ проводили во Всероссийском центре карантина растений (Московская обл., Россия). Изоляты Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms204, Cms M1, Cms M2) получены из Всероссийского центра карантина растений.

Реагенты. В работе использовали конъюгаты пероксидазы хрена с козьими антителами против иммуноглобулинов кролика (Имтек, Россия), Тритон Х-100, Твин-20 (Химмед, Россия), бычий сывороточный альбумин (БСА), однокомпонентный субстратный раствор для пероксидазы, содержащий тетраметилбензидин (ТМБ) и пероксид водорода (НВО Иммунотех, Россия), золотохлористоводородную кислоту (HAuCl₄), азид натрия (Sigma-Aldrich, США). Все использованные реагенты (соли, кислоты и растворители) были химической чистоты.

Для проведения иммуноферментного анализа использовали 96-луночные прозрачные микропланшеты (Corning Costar, США). Все растворы были приготовлены с использованием воды Milli-Q (Millipore, США).

В работе использовали иммунохроматографические мембраны, приобретенные в Advanced Microdevices (Индия): нитроцеллюлозные мембраны CNPC-12µ, стекловолоконные мембраны для конъюгата (PT-R5), впитывающие мембраны для проб (GFB-R4) и конечные абсорбирующие мембраны (AP045).

Получение антисывороток и выделение поликлональных антител. Для получения антисывороток проводили иммунизацию кроликов породы шиншиллы 72-часовой культурой бактерий D. solani из расчета 10⁹ клеток на инъекцию. При иммунизации с недельными интервалами использовали неполный адъювант Фрейнда, 1-я и 6-я инъекции — подкожные, со 2-й по 5-ю инъекции — внутримышечные. Забор крови проводили через 7…14 дней после последней инъекции. Иммуноглобулины класса G (IgG) выделяли из антисыворотки с помощью осаждения насыщенным раствором сульфата аммония и аффинной хроматографией на колонке с белком A-Сефароза CL-4B (Sigma-Aldrich, США).

Получение конъюгатов антител. Для ИФА антитела конъюгировали с пероксидазой хрена, используя перийодатный метод синтеза с модификациями, описанными в [11].

Для ИХА антитела конъюгировали с наночастицами золота (НЧЗ). Предварительно методом цитратного восстановления синтезировали НЧЗ с диаметром 20 нм [12]. Затем НЧЗ конъюгировали с антителами (IgG), специфичными к D. solani, методом физической адсорбции согласно протоколу, описанному в [13].

Приготовление экстракта клубней картофеля. Для анализа готовили экстракт по следующей технологии: из каждой партии клубней картофеля (200 клубней) вырезали конусы сосудистой ткани 3…5 мм в диаметре. Пробы помещали в колбу, экстрагировали бактерии в течение 16…24 ч стерильным 50 мМ фосфатным буфером (ФБС), рН 7,0, и удаляли фильтрацией крупные частицы. Полученный экстракт далее центрифугировали в течение 10 мин при 10000 g, 4 °C, после удаления супернатанта осадок ресуспендировали в буфере для проб и использовали для анализа.

Характеристика сывороток и выделенных антител методом иммуноферментного анализа. Бактерии D. solani 28711 (1×10⁸ кл./мл в ФБС) сорбировали в лунки микропланшета в течение 2 ч при 37 °C. Не связавшиеся реагенты удаляли трехкратной промывкой лунок ФБС с добавлением 0,05 % Тритон X-100 (ФБС-Т), используя Thermo Electron WellWash 4 MK2 (Thermo Scientific, США). После отмывки в лунки вносили антисыворотки (разбавление от 10³ до 10⁸ в ФБС-Т) или выделенные IgG (от 0,1 до 300 нг/мл в ФБС-Т) инкубировали в течение 1 ч при 37 °C. Микропланшет трижды отмывали ФБС-Т, после чего добавляли конъюгат пероксидазы с козьими антителами против иммуноглобулинов кролика (разведение коммерческого препарата 1:5000 в ФБС-Т), инкубировали в течение 1 ч при 37 °C. После отмывки в лунки микропланшета вносили 100 мкл субстратной смеси, содержащей ТМБ и H₂O₂, и инкубировали 15 мин при комнатной температуре. Ферментативную реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1 М серной кислоты. Оптическую плотность измеряли при длине волны 450 нм (ОП₄₅₀) с помощью планшетного спектрофотомера Zenyth 3100 (Anthos Labtec Instruments, Австрия). Для обработки полученных данных использовали компьютерную программу Origin Pro 9.0 (Origin Lab, США). Титром антисыворотки считали ее разбавление, сигнал в ИФА для которого равен сумме среднего значения ОП₄₅₀ и трех стандартных отклонений для сыворотки не иммунизированного животного (отрицательный контроль).

Проведение сэндвич иммуноферментного анализа. ИФА на основе полученного конъюгата антител с пероксидазой проводили по методике, разработанной в ФИЦ картофеля им. А.Г. Лорха для возбудителей бактериальных болезней картофеля и описанной в [11].

Получение иммунохроматографических тест-полосок. Иммунохроматографические тест-полоски собирали в сэндвич формате по схеме и протоколу, описанным в [14]. В тестовую зону наносили поликлональные антитела, специфичные к D. solani (1 мг/мл в ФБC с 5 % глицерина и 0,03 % NaN₃), в контрольную зону наносили стафилококковый белок А (0,5 мг/мл в ФБC с 5 % глицерина и 0,03 % NaN₃). Конъюгат НЧЗ с антителами наносили на стекловолоконную мембрану (ширина 5 мм) из расчета 1,6 мкл на мм. Мембраны сушили при 37 °C не менее 6 ч, после чего собирали мульти-мембранный композит, состоящий из впитывающей мембраны для пробы, мембраны с конъюгатом, нитроцеллюлозной мембраны и впитывающей мембраны. Для получения иммунохроматографических тест-полосок (ширина 3 мм) мульти-мембранный композит нарезали с использованием автоматической гильотины Index Cutter-1 (A-Point Technologies, США). Тест-полоски упаковывали в пакеты из ламинированной алюминиевой фольги, содержащие силикагель, и хранили при комнатной температуре.

Проведение иммунохроматографического анализа. Нижний край тест-полоски погружали непосредственно в анализируемую пробу (буфер или экстракт) и через 15 мин визуально оценивали результат. Появление двух окрашенных полос свидетельствовало о наличии инфекции в пробе; одна полоса в контрольной зоне означала отсутствие бактерий в пробе или их наличие, но в концентрации ниже предела обнаружения тест-полосок.

Результаты исследования и обсуждения

Характеристика полученных антисывороток и выделенных IgG. В результате иммунизации кроликов получены по четыре антисыворотки от двух кроликов, взятые через 7 и 14 дней после окончания инъекции. Специфичность и титр сывороток определяли методом непрямого ИФА. Результаты приведены на рис. 1. Из рис. 1, а видно, что титры полученных антисывороток отличаются незначительно, максимальный титр (1×10⁷) показали две сыворотки (№ 1, 2). Неспецифический титр антисывороток относительно близкородственного патогена — бактерии P. аtrosepticum, также вызывающей симптомы черной ножки, был на два порядка ниже специфического (рис. 1). При этом неспецифическое связывание антисывороток № 1 и 2 было ниже, чем антисывороток № 3 и 4. В соответствии с полученными результатами для дальнейшей работы IgG были выделены из антисывороток № 1 и 2.

Для выделенных из сывороток методом ИФА антител подтверждена высокая антиген-связывающая активность относительно бактерий D. solani (рис. 2). Антитела распознавали клетки D. solani, сорбированные в лунках микропланшета при концентрации 1 нг/мл и выше. Полученные концентрационные зависимости (рис. 2) говорят о присутствии в препарате выделенных IgG значительного количества высокоаффинных молекул. Оба выделенных препарата антител перспективны для разработки иммуноферментных и иммунохроматографических тест-систем.

Для дальнейшей работы использовали антитела, выделенные из антисыворотки № 1.

Рис. 1. Сравнение антисывороток, специфичных к D. solani, методом ИФА при сорбции на микропланшете бактерий D. solani (а) и P. atrosepticum (б): 1–4 — номера сывороток

 

 

Fig. 1. Comparison of antisera specific to D. solani through ELISA, with absorption of D. solani bacteria (a) and P. atrosepticum (b) on a microplate: 1–4 — numbers of serum

 

Рис. 2. Концентрационные зависимости антител, полученные методом ИФА, для клеток D. solani, сорбированных в лунках микропланшета в концентрации 1×108 кл./мл: 1, 2 — номера сывороток, из которых выделены антитела

Fig. 2. Concentration dependences of antibodies specific to D. solani cells through ELISA, absorbed in a microplate at a concentration of 1×108 cells/mL: 1, 2 — numbers of serum, from which antibodies were purified

Применение полученных антител в иммуноаналитических тест-системах. Сэндвич формат анализа — наиболее эффективное решение для иммунодетекции бактерий, являющихся поливалентными антигенами [14]. Поэтому мы использовали выделенные антитела в двух вариантах: 1) как захватывающие, сорбируя их в лунках иммуноферментного микропланшета и в тестовой зоне иммунохроматографической тест-полоски; 2) как проявляющие, выявляя бактерии конъюгатами антител с пероксидазой в ИФА и конъюгатами антител с НЧЗ в ИХА. В обеих тест-системах (иммуноферментной и иммунохроматографической) в присутствии бактерии формируется тройной комплекс [захватывающие антитела] — [бактерии] — [проявляющий конъюгат антител]. Обе системы тестировали с использованием панели коллекционных бактерий, включавшей 7 бактерий рода Dickeya и 16 бактерий, относящихся к растительным патогенам родов Ralstonia, Сlavibacter, Pectobacterium, Pseudomonas. В результате ИФА и ИХА показали положительные результаты для всех бактерий рода Dickeya (табл. 1). Несмотря на то, что антитела были получены при иммунизации клетками D. solani, эффективность распознавания таких видов, как D. dianthicola, D. chrysanthemi, D. dadantii subsp. dadantii, D. paradisiaca, не уступала иммуногенному виду. Только для D. zeae сигнал был в 7 раз слабее относительно других видов Dickeya. Более того, сравнение пределов обнаружения показало, что тест-система выявляет в 4 раза меньшее количество клеток (2×10⁴ кл./мл) D. dianthicola, чем D. solani (рис. 3). Предел иммунохроматографического обнаружения клеток D. solani составил 2×10⁵ кл./мл (рис. 4), что незначительно уступает иммуноферментной системе, однако соответствует требованиям ГОСТ [15] к чувствительности иммуноаналитических методов. При этом время анализа с использованием иммунохроматографической тест-системы — 15 мин, в отличие от 5–6 ч для иммуноферментной.

Таблица 1. Результаты тестирования чистых культур бактерий (1×10⁷ кл./мл) ИФА и ИХА тест­системами

№	Коллекц. номер Института карантина растений	Бактерия		Тест­система
				ИФА	ИХА
			ОП450	Результат	Результат
1	0039	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv.2	0	–	–
2	0040	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv.2	0	–	–
3	0141	Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum	0	–	–
4	0142	Pectobacterium atrosepticum	0	–	–
5	0143	Pectobacterium atrosepticum	0	–	–
6	0144	Diсkeya dianthicola	2,41	+	+
7	0235	Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus	0	–	–
8	0239	Сlavibacter michiganensis subsp. michiganensis	0	–	–
9	0240	Сlavibacter michiganensis subsp. michiganensis	0	–	–
10	0222	Pseudomonas syringae pv. syringae	0	–	–
11	0223	Pseudomonas syringae pv. syringae	0	–	–
12	0327	Pectobacterium carotovorum subsp. odoriferum	0	–	–
13	0328	Pectobacterium wasabiae	0	–	–
14	0329	Pectobacterium betavasculorum	0	–	–
15	0330	Pectobacterium cacticida	0	–	–
16	0331	Dickeya chrysanthemi	2,46	+	+
17	0332	Dickeya dadantii subsp. Dadantii	1,89	+	+
18	0333	Dickeya paradisiaca	2,16	+	–
19	0334	Dickeya zeae	0,28	+	+
20	0335	Pseudomonas fuscovaginae	0	–	–
21	0336	Dickeya dadantii subsp. dieffenbachiae	2,19	+	+
22	0353	Dickeya solani	1,98	+	+

Table 1. Results of testing pure cultures of bacteria (1 × 10⁷ cells/mL) through ELISA and LFIA test systems

№	Collection number of Russian Plant Quarantine Center	Bacterium	Test system
			ELISA		LFIA
			OD450	Result	Result
1	0039	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv.2	0	–	–
2	0040	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv.2	0	–	–
3	0141	Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum	0	–	–
4	0142	Pectobacterium atrosepticum	0	–	–
5	0143	Pectobacterium atrosepticum	0	–	–
6	0144	Diсkeya dianthicola	2.41	+	+
7	0235	Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus	0	–	–
8	0239	Сlavibacter michiganensis subsp. michiganensis	0	–	–
9	0240	Сlavibacter michiganensis subsp. michiganensis	0	–	–
10	0222	Pseudomonas syringae pv. syringae	0	–	–
11	0223	Pseudomonas syringae pv. syringae	0	–	–
12	0327	Pectobacterium carotovorum subsp. odoriferum	0	–	–
13	0328	Pectobacterium wasabiae	0	–	–
14	0329	Pectobacterium betavasculorum	0	–	–
15	0330	Pectobacterium cacticida	0	–	–
16	0331	Dickeya chrysanthemi	2.46	+	+
17	0332	Dickeya dadantii subsp. Dadantii	1.89	+	+
18	0333	Dickeya paradisiaca	2.16	+	–
19	0334	Dickeya zeae	0.28	+	+
20	0335	Pseudomonas fuscovaginae	0	–	–
21	0336	Dickeya dadantii subsp. dieffenbachiae	2.19	+	+
22	0353	Dickeya solani	1.98	+	+

 

Рис. 3. Концентрационные зависимости иммуноферментного анализа проб, содержащих разное количество клеток D. solani и D. dianthicola

Fig 3. Concentration dependences obtained through ELISA from samples with different bacterial concentration of D. solani and D. dianthicola

 

Для всех бактерий, не относящихся к роду Dickeya, отсутствовали аналитические сигналы обеих тест-систем (см. табл. 1). Здоровый растительный материал (клубни, листья) также не давал фоновых сигналов. Таким образом, тест-системы на основе полученных поликлональных антител могут быть использованы для выявления инфекций, вызываемых бактериями Dickeya spp.

Тестирование клубневого материала. Партии семенного картофеля, полученные из разных регионов (Киргизия, Московская, Орловская, Брянская области), тестировали иммуноферментной и иммунохроматографической тест-системами для детекции Dickeya spp. (табл. 2). В результате из 43 проб (каждая из которых является суммарной для партии от 40 до 200 клубней) иммуноферментной системой выявлено 24 зараженные пробы, для 19 проб инфекция не обнаружена. Иммунохроматографическая тест-система выявила меньшее количество зараженных проб — 18 положительных и 25 отрицательных. При этом иммунохроматографическая система подтвердила отрицательные пробы, определенные иммуноферментной системой, в 100 %, а положительные — в 75 % случаев. Отличия результатов можно объяснить тем, что чувствительность иммунохроматографической тест-системы ниже, чем иммуноферментной. Поэтому пробы с низким содержанием Dickeya spp. дали отрицательные результаты в ИХА.

Рис. 4. Тест-полоски после анализа проб, содержащих разное количество клеток D. solani: 0 — отрицательный контроль; 1–1,4×105; 2–4,1×105; 3–1,2×106; 4–3,7×106; 5–1,1×107; 6–3,3×107; 7–1×108 кл./мл и соответствующая зависимость интенсивности окрашивания тестовых зон от концентрации D. solani

Fig. 4. Test strips after analysis of samples with different concentrations of D. solani: 0 — negative control; 1–1.4×105; 2–4.1×105; 3–1.2×106; 4–3.7×106; 5–1.1×107; 6–3.3×107; 7–1×108 cells/mL and the corresponding dependence of the color intensity of the test zones on the concentration of D. solani

Таблица 2. Результаты иммуноферментного и иммунохроматографического тестирования клубневого материала на зараженность бактериями Dickeya spp.

Проба*		ИФА		ИХА
№ п/п	Сорт, репродукция	ОП450	Результат анализа	Результат анализа
1	Леди Клер, 3 репр.	0,062	­-	­-
2	Опал, 3 репр.	0,088	­-	­-
3	Опал, 3 репр.	0,113	­-	­-
4	Королёк, 2 репр.	0,073	­-	­-
5	Леди Клер, элита	1,289	+	+
6	Леди Клер, 1 репр.	0,057	­-	­-
7	Остин, 1 репр.	2,358	+	+
8	Королёк, 2 репр.	0,117	­-	­-
9	Норт, элита	0,073	­-	­-
10	Барс, элита	2,111	+	+
11	Опал, 3 репр.	2,635	+	+
12	Королёк, 2 репр.	0,155	­-	­-
13	Импала, ССЭ	2,308	+	+
14	Ривьера, ССЭ	0,095	­-	­-
15	Коллете, ССЭ	0,119	­-	­-
16	Удача, ППП	0,120	­-	­-
17	Коллете, ППП	2,493	+	+
18	Дезире, ППП	0,427	+	­-
19	Фиолетовый, ППП	0,656	+	­-
20	Фиолетовый, ССЭ	0,303	+	­-
21	Арроу, ССЭ	0,070	­-	­-
22	Удача, ССЭ	0,276	+	­-
23	Ред Скарлет, ППП	1,477	+	+
24	Импала, ППП	2,476	+	+
25	Ред Скарлет, ССЭ	0,092	­-	­-
26	Дезире, ССЭ	0,730	+	­-
27	Ривьера, ППП	0,116	­-	­-
28	Гранд, ППП	0,439	+	+
29	Варяг, ППП	0,991	+	­-
30	Кумач, ППП	2,395	+	+
31	Гулливер, ППП	0,092	­-	­-
32	Метеор, ППП	1,800	+	+
33	Ред Леди, элита	1,977	+	+
34	Королева Анна, элита	0,170	­-	­-
35	Ред Скарлет, РС­1	0,110	­-	­-
36	Санте, элита	0,092	­-	­-
37	Гала, 3 репр.	2,818	+	+
38	ВР­808, 2 репр.	2,281	+	+
39	Брук, 1 репр.	2,120	+	+
40	Леди Клер, 2 репр.	2,386	+	+
41	Леди Клер, 2 репр	0,789	+	+
42	Гала, 2 репр.	1,177	+	+
43	Накра, мини­клубни	0,064	­-	­-

*Пробы получены: 1–12 — из Киргизии; 13–32, 37–42 — из Московской области; 33–36 — из Орловской области; 43 — из Брянской области.

Table 2. Results of ELISA and LFIA testing of Dickeya spp. infection in potato tubers

Sample*			ELISA	LFIA
№	Cultivar, reproduction	OD450	Result	Result
1	Ledi Kler, 3 repr.	0.062	­-	­-
2	Opal, 3 repr.	0.088	­-	­-
3	Opal, 3 repr.	0.113	­-	­-
4	Korolek, 2 repr.	0.073	­-	­-
5	Ledi Kler, elite	1.289	+	+
6	Ledi Kler, 1 repr.	0.057	­-	­-
7	Ostin, 1 repr.	2.358	+	+
8	Korolek, 2 repr.	0.117	­-	­-
9	Nort, elite	0.073	­-	­-
10	Bars, elite	2.111	+	+
11	Opal, 3 repr.	2.635	+	+
12	Korolek, 2 repr.	0.155	­-	­-
13	Impala, SSE	2.308	+	+
14	Rivyera, SSE	0.095	­-	­-
15	Kollete, SSE	0.119	­-	­-
16	Udacha, FFR	0.120	­-	­-
17	Kollete, FFR	2.493	+	+
18	Dezire, FFR	0.427	+	­-
19	Fioletovy, FFR	0.656	+	­-
20	Fioletovy, SSE	0.303	+	­-
21	Arrou, SSE	0.070	­-	­-
22	Udacha, SSE	0.276	+	­-
23	Red Skarlet, FFR	1.477	+	+
24	Impala, FFR	2.476	+	+
25	Red Skarlet, SSE	0.092	­-	­-
26	Dezire, SSE	0.730	+	­-
27	Rivyera, FFR	0.116	­-	­-
28	Grand, FFR	0.439	+	+
29	Varyag, FFR	0.991	+	­-
30	Kumach, FFR	2.395	+	+
31	Gulliver, FFR	0.092	­-	­-
32	Meteor, FFR	1.800	+	+
33	Red Ledi, elite	1.977	+	+
34	Koroleva Anna, elite	0.170	­-	­-
35	Red Skarlet, A	0.110	­-	­-
36	Sante, elite	0.092	­-	­-
37	Gala, 3 repr.	2.818	+	+
38	VR­808, 2 repr.	2.281	+	+
39	Bruk, 1 repr.	2.120	+	+
40	Ledi Kler, 2 repr.	2.386	+	+
41	Ledi Kler, 2 repr	0.789	+	+
42	Gala, 2 repr.	1.177	+	+
43	Nakra, mini­tubers	0.064	­-	­-

*Samples received: 1–12 — from Kyrgyzstan; 13–32, 37–42 — from the Moscow region; 33–36 — from the Oryol region; 43 — from the Bryansk region.

Заключение

В результате иммунизации кроликов получены антисыворотки с высоким титром (максимальный титр — 1×10⁷) к клеткам D. solani. Препараты поликлональных антител, выделенных из лучших сывороток, демонстрировали высокое сродство к иммуногенным бактериям. Характеристика иммуноферментной и иммунохроматографической сэндвич тест-систем, в которых выделенные антитела использовали и как захватывающие, и как проявляющие, показала специфичное распознавание основных видов Dickeya spp. При этом для бактерий Ralstonia, Сlavibacter, Pectobacterium и Pseudomonas не наблюдались кросс-реакции, как и для здорового клубневого и листового материала картофеля. Иммунохроматографическая тест-система по чувствительности несколько уступает иммуноферментной, но экспрессность (15 мин) и простота проведения анализа позволяют рассматривать ее как средство быстрого внелабораторного контроля картофельного материала. Первые испытания при характеристике зараженности клубневого материала бактериями Dickeya spp. подтвердили эффективность нового препарата антител и показали высокую степень соответствия результатов иммуноферментного и иммунохроматографического тестирования. Представленные результаты свидетельствуют о целесообразности дальнейшей характеристики и оптимизации тест-систем с целью их производства как средств массового тестирования в картофелеводстве.

Об авторах

Шиатеса Разо

ФИЦ биотехнологии РАН; Российский университет дружбы народов

Автор, ответственный за переписку.
Email: 1042175063@rudn.ru
ORCID iD: 0000-0002-4131-3797

аспирант, Аграрно-технологический институт

119071, Российская Федерация, г. Москва, Ленинский проспект, д. 33; 117198, Российская Федерация, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8/2

Павел Андреевич Галушка

Федеральный исследовательский центр картофеля имени А.Г. Лорха

Email: pavel_galushka@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4680-9684

кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник

140051, Российская Федерация, Московская обл., п. Красково, ул. Лорха, д. 23

Юрий Алексеевич Варицев

Федеральный исследовательский центр картофеля имени А.Г. Лорха

Email: varyuriy@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2329-7965

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

140051, Российская Федерация, Московская обл., п. Красково, ул. Лорха, д. 23

Анатолий Виталиевич Жердев

ФИЦ биотехнологии РАН

Email: zherdev@inbi.ras.ru
ORCID iD: 0000-0003-3008-2839

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник

119071, Российская Федерация, г. Москва, Ленинский проспект, д. 33

Ирина Викторовна Сафенкова

ФИЦ биотехнологии РАН

Email: saf-iri@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3621-4321

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

119071, Российская Федерация, г. Москва, Ленинский проспект, д. 33

Елена Николаевна Пакина

Российский университет дружбы народов

Email: e-pakina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1647-9138

кандидат биологических наук, доцент, директор, Агробиотехнологический департамент, Аграрно-технологический институт

117198, Российская Федерация, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8/2

Борис Борисович Дзантиев

ФИЦ биотехнологии РАН

Email: dzantiev@inbi.ras.ru
ORCID iD: 0000-0003-4008-4918

доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией

119071, Российская Федерация, г. Москва, Ленинский проспект, д. 33

Список литературы

Дополнительные файлы