Отправить статью по E-mail 
Скрининг генов устойчивости к пирикуляриозу у селекционных образцов риса
- Авторы: Вожжова Н.Н.1, Жогалева О.С.1, Купрейшвили Н.Т.1, Дубина А.Ю.1, Костылев П.И.1
-
Учреждения:
- Аграрный научный центр «Донской»
- Выпуск: Том 16, № 4 (2021)
- Страницы: 326-336
- Раздел: Защита растений
- URL: https://agrojournal.rudn.ru/agronomy/article/view/19700
- DOI: https://doi.org/10.22363/2312-797X-2021-16-4-326-336
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Рис - одна из наиболее распространенных сельскохозяйственных культур в мире. Для решения проблемы продовольственной безопасности России необходимо увеличивать урожайность сельскохозяйственных культур или расширять их посевные площади. В связи с невозможностью в настоящее время расширения посевных площадей риса в Ростовской области и необходимостью поддержания и увеличения его урожайности, необходимо создавать новые, устойчивые к болезням сорта. Генотипы риса, имеющие несколько генов устойчивости к пирикуляриозу, избегают значительных потерь урожая. Так как пирамидирование и отбор генов устойчивости в одном генотипе традиционными методами селекции осложнен, актуальным является поиск гомозиготных образцов методами маркер-вспомогательной селекции. Цель исследования - идентификация генов устойчивости к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2, Pi-33 и Pi-ta у селекционных образцов риса методами MAS. В исследовании использовались CTAB-метод выделения ДНК, ПЦР, электрофорез на агарозных и полиакриламидных гелях. Полученные гели окрашивались в растворе этидиум бромида и фотографировались в ультрафиолете. В качестве контроля наличия генов устойчивости к пирикуляриозу использовали следующие родительские сорта: C104-LAC - для генов Pi-1 и Pi-33, C101-A-51 - для гена Pi-2, IR36 - для гена Pi-ta; Новатор и Боярин как контроли не функциональных аллелей всех изучаемых генов. Анализировалось 446 селекционных образцов седьмого поколения F7. Выявлено 127 образцов риса, сочетающих 2 или 3 различных гена устойчивости к пирикуляриозу. У 43 образцов (1128/1, 1149/3, 1171/2, 1177/3, 1177/4, 1186/4 и др.) идентифицировано соче- тание генов Pi-2 и Pi-33. Наиболее интересны для отбора и дальнейшей селекционной работы образцы с 3 генами устойчивости. Рекомендуем использовать образцы риса с сочетаниями генов устойчивости Pi-1+Pi-2+Pi-33 (1197/1, 1226/2, 1271/1, 1272/2), Pi-1+Pi-2+Pi-ta (1197/4, 1304/2, 1304/3, 1482/3, 1482/4, 1486/1) и Pi-2+Pi-33+Pi-ta (1064/1, 1064/3, 1281/2, 1281/3, 1281/4, 1282/2, 1283/1, 1283/2, 1284/3) для создания новых устойчивых к пирикуляриозу сортов.
Ключевые слова
Полный текст
Введение
Рис относится к числу наиболее распространенных в мире сельскохозяйственных культур. Он повсеместно используется в пищу, а в странах Азии является одним из основных продуктов питания [1]. С ростом населения все чаще возникают проблемы недостатка еды и скрытого голода [1]. Для решения проблемы продовольственной безопасности необходимо увеличивать урожайность сельскохозяйственных культур или расширять их посевные площади.
В России рис массово производится в регионах Южного федерального округа. Расширение площадей выращивания риса в Ростовской области в настоящее время не представляется возможным по причине недостатка воды в уже существующих оросительных системах [2].
Чтобы поддерживать и увеличивать урожайность зерновых культур, необходимо создавать новые, устойчивые к болезням, сорта. Наиболее вредоносной болезнью у риса является пирикуляриоз [2—4].
Исследователи в разных странах выявляют наличие генов устойчивости к пирикуляриозу в коллекционных образцах и выращиваемых сортах риса. Так в [5] идентифицировали 15 сортов риса, произрастающих в провинции Северная Суматра (Индонезия), которые обладают шестью генами устойчивости — Pi-d2, Pup1, Pi-ta2, Pi-37, Pi-z и Pi-b. В 2018 г. авторы [6] проводили скрининг на молекулярном и полевом уровнях доноров генов устойчивости к пирикуляриозу среди традиционных сортов риса в штате Керала (Индия) и идентифицировали наличие генов Pi 1, Pi 2 и Pi kh.
Ведется маркер-ориентированный отбор гомозиготных по нескольким генам образцов риса, полученных от скрещивания элитных возделываемых сортов с образцами-донорами генов устойчивости к пирикуляриозу в Индии [7] и Китае [8]. Сообщается, что в Колумбии сочетание генов устойчивости Pi1+Pi2+Pi33 доказало свою эффективность в течение более 10 лет [9]. В Тайланде проводилось QTL картирование устойчивости к пирикуляриозу на рекомбинантных инбредных линиях, полученных от скрещивания восприимчивого и устойчивого сортов, и была установлена локализация одного из найденных QTL в непосредственной близости к комплексу трех основных генов устойчивости Pi 7(t), Pi 1 и Pi lm2 [10].
Генотипы риса, у которых имеется несколько генов устойчивости к пирикуляриозу, менее подвержены эпифитотиям, а, следовательно, избегают значительных потерь в урожайности [11].
В процессе пирамидирования нескольких генов в одном генотипе при помощи традиционных методов селекции возникают затруднения, связанные с эффектами доминирования и эпистаза [11]. Поиск генотипа с желаемыми генами устойчивости осложняется влиянием искусственного отбора, так как селекционер в полевых условиях отбирает растения по ряду фенотипических признаков.
Таким образом, актуальным является поиск гомозиготных по нескольким генам устойчивости к пирикуляриозу образцов риса методами маркер-вспомогательной селекции (MAS).
Цель исследования — идентификация генов устойчивости к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2, Pi-33 и Pi-ta у селекционных образцов риса методами MAS.
Материалы и методы исследования
В качестве объекта исследования использовали 446 селекционных образцов риса F7. Их выращивали на чеках обособленного подразделения «Пролетарское» ФГБНУ «АНЦ «Донской» в 2019 г. на делянках длиной 2 м, с междурядьем 30 см (площадь делянки — 0,6 м2).
Лабораторные анализы проводили в 2019—2020 гг. в лаборатории маркерной селекции ФГБНУ «АНЦ «Донской». Образцы риса измельчали гомогенизатором Bertin Precellys 24 в пробирках 2,0 мл с керамическими шариками диаметром 28 мм. ДНК образцов выделяли по методу Мюррей [12] с использованием набора «ДНК-Экстран-3» (Синтол, Россия). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в амплификаторе Bio-Rad T-100.
Условия амплификации использовали согласно разработанным ранее протоколам, отдельно для каждого из исследуемых генов [13—15]. Полученные продукты амплификации разделяли на 2 % агарозных и 8 % полиакриламидных гелях в зависимости от определяемого гена устойчивости к пирикуляриозу. Все гели окрашивались в 0,1 % растворе этидиум бромида в 0,5-кратном TBE-буфере. Детекцию электрофореграмм проводили в ультрафиолетовом свете прибором BioRad GelDoc XR+ и анализировали приложением ImageLab 6.0.1.
В качестве контроля наличия генов устойчивости к пирикуляриозу использовали следующие родительские сорта: C104-LAC — для генов Pi-1 и Pi-33, C101-A-51 — для гена Pi-2, IR36 — для гена Pi-ta; Новатор и Боярин — как контроли нефункциональных аллелей всех изучаемых генов.
Для оценки размера выявленных ампликонов использовали маркеры молекулярного веса Evrogen 50+ bp DNA Ladder (50—700 bp) на полиакриламидных гелях и Thermo Scientific GeneRuler 50 bp (50—1000 bp) на агарозных гелях.
Результаты исследования и обсуждения
В результате проведенного скрининга селекционных образцов риса F7 по определению генов устойчивости к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2, Pi-33 и Pi-ta было получено множество электрофореграмм на агарозных и полиакриламидных гелях. Электрофореграмма по определению гена Pi-ta на агарозном геле приведена на рис. 1.
Fig. 1. Electropherogram of screening rice samples for the presence of the Pi-ta blast resistance gene on agarose gel: 1 — Thermo Scientific GeneRuler molecular weight marker 50 bp (50—1000 bp); 2 — deionized H2O (negative control); 3 — IR36 (positive control); 4 — D7787/1; 5 — D7787/2; 6 — D7787/3; 7 — D7787/4; 8 — D7787/5; 9 — D7787/6; 10 — D7787/7; 11 — D7787/8; 12 — D7787/9; 13 — D7787/10; 14—1064/1; 15—1064/2; 16—1064/3; 17—1064/4; 18—1065/1
Фрагменты ДНК, аналогичные ампликону положительного контроля (сорта-донора гена устойчивости IR36) наблюдались в образцах 1064/1, 1064/2, 1064/3 и 1064/4, следовательно, они несут в себе доминантный аллель гена Pi-ta.
У образца 1065/1 аллели гена устойчивости к пирикуляриозу Pi-ta не идентифицированы. У остальных образцов (см. рис. 1), наблюдаются ампликоны, ассоциированные с нефункциональным гомозиготным аллелем гена pi-ta.
Электрофореграмма по определению гена Pi-1 на полиакриламидном геле приведена на рис. 2.
Fig. 2. Electropherogram of screening rice samples for the presence of blast resistance gene Pi-1 on a polyacrylamide gel: 1 — DNA marker 50+ bp DNA Ladder Evrogen (50—700 bp); 2 — C104-LAC (positive control); 3 — D7787/1; 4 — D7787/2; 5 — D7787/3; 6 — D7787/4; 7 — D7787/5; 8 — D7787/6; 9 — D7787/7; 10 — D7787 / 8; 11 — D7787/9; 12 — D7787/10; 13—1141/1; 14—1141/2; 15—1141/3
Амплифицированные фрагменты ДНК размером 137 пар нуклеотидов, аналогичным размеру ампликона сорта C104-LAC (положительный контроль), были идентифицированы в образцах Д 7787/1, Д 7787/2, Д 7787/3, Д 7787/4, Д 7787/5, Д 7787/6, Д 7787/7, Д 7787/8, Д 7787/9, Д 7787/10 и 1141/1, следовательно, у них имеется функциональный аллель гена устойчивости к пирикуляриозу Pi-1. У образцов 1141/2 и 1141/3 выявлен ампликон меньшего размера, что свидетельствует о наличии нефункционального (рецессивного) аллеля гена устойчивости к пирикуляриозу pi-1.
В результате проведенной оценки всех полученных электрофореграмм по генам устойчивости к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2, Pi-33 и Pi-ta было выявлено распределение их аллелей у селекционных образцов риса (табл. 1).
Таблица 1. Распределение аллелей генов Pi-1, Pi-2, Pi-33 и Pi-ta у селекционных образцов риса
Аллели гена | Количество образцов, несущих аллели гена, шт. | |||
Pi-1 | Pi-2 | Pi-33 | Pi-ta | |
Функциональный гомозиготный (доминантный) | 54 | 136 | 192 | 131 |
Гетерозиготный | 1 | 5 | 16 | 6 |
Не функциональный гомозиготный (рецессивный) | 204 | 285 | 121 | 285 |
Аллель не идентифицирован | 247 | 80 | 177 | 24 |
Большое число образцов, у которых ни один из аллелей изучаемых генов не был идентифицирован, объясняется высокой вариативностью нуклеотидной последовательности в их геномах, из-за чего праймеры при проведении ПЦР не были комплементарны начальной матрице.
При объединении результатов по каждому из изученных генов было установлено распределение образцов риса по количеству сочетаемых генов устойчивости к пирикуляриозу (рис. 3).
Рис. 3. Распределение образцов риса по количеству сочетаемых генов устойчивости к пирикуляриозу
Образцы, у которых не было идентифицировано ни одного изучаемого гена, составили 20, 4 % (91 шт.) Наличие одного гена устойчивости к пирикуляриозу наблюдалось у 51,12 % образцов (228 шт.), а сочетание двух генов устойчивости в различных комбинациях — у 24,22 % образцов (108 шт.).
Сочетание из 3 генов устойчивости к пирикуляриозу было идентифицировано у 4,26 % образцов риса (19 шт.).
Образцы риса, несущие сочетание двух и трех генов устойчивости к пирикуляриозу, приведены в табл. 2.
Таблица 2. Выявленные образцы риса с несколькими генами устойчивости к пирикуляриозу
Сочетание генов устойчивости | Количество образцов | Наименование образцов |
Pi1+2 | 5 | 1270/4, 1271/2, 1293/3, 1318/3, 1371/1 |
Pi1+33 | 12 | 1231/4, 1263/3, 1268/3, 1277/1, 1277/2, 1277/3, 1322/1, 1323/1, 1323/2, 1323/3, 1323/4, 1457/2 |
Pi1+ta | 9 | 1141/1, 1304/4, 1468/1, 1468/2, 1476/1, 1476/2, 1486/2, 1486/3, 1486/4 |
Pi2+33 | 43 | 1128/1, 1149/3, 1171/2, 1177/3, 1177/4, 1186/4 и др. |
Pi2+ta | 22 | 1064/2, 1064/4, 1135/4, 1141/3, 1141/4, 1151/1 и др. |
Pi33+ta | 16 | 1065/2, 1242/2, 1242/3, 1242/4, 1281/1, 1281/3, 1281/4 и др. |
Pi33+b | 1 | 1127/2 |
Pi1+2+33 | 4 | 1197/1, 1226/2, 1271/1, 1272/2 |
Pi1+2+ta | 6 | 1197/4, 1304/2, 1304/3, 1482/3, 1482/4, 1486/1 |
Pi2+Pi33+Pi-ta | 9 | 1064/1, 1064/3, 1281/2, 1281/3, 1281/4, 1282/2, 1283/1, 1283/2, 1284/3 |
Всего идентифицировано 127 образцов риса, несущих сочетание 2 и 3 различных генов устойчивости к пирикуляриозу. У 43 образцов (наибольшее количество) было выявлено сочетание генов устойчивости Pi-2 и Pi-33.
Наиболее интересными для отбора являются образцы с тремя различными генами устойчивости к болезни.
Заключение
В результате проведенных методами MAS исследований были идентифицированы гены устойчивости к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2, Pi-33 и Pi-ta у селекционных образцов риса.
Для дальнейшей селекционной работы по созданию устойчивых к пирикуляриозу сортов риса рекомендуем использовать выявленные образцы с тремя генами устойчивости: Pi-1+Pi-2+Pi-33 (1197/1, 1226/2, 1271/1, 1272/2), Pi-1+Pi-2+Pi-ta (1197/4, 1304/2, 1304/3, 1482/3, 1482/4, 1486/1) и Pi-2+Pi-33+Pi-ta (1064/1, 1064/3, 1281/2, 1281/3, 1281/4, 1282/2, 1283/1, 1283/2, 1284/3).
1 Food and Agriculture Organization of the United Nations. Режим доступа: http://www.fao.org/state-of-food-securitynutrition/ru/ (Дата обращения 22.09.2021) (Food and Agriculture Organization of the United Nations. Available from: http://www.fao.org/state-of-food-security-nutrition/ru/ [Accessed 22th September 2021])
2 Министерство природных ресурсов и экологии Ростовской области. Водные ресурсы. Режим доступа: https://xn — d1ahaoghbejbc5k.xn — p1ai/activity/356/?nav-news=page-2 (Дата обращения 06.10.2021) (Ministry of Natural Resources and Ecology of the Rostov Region. Water resources. Available from: https://xn — d1ahaoghbejbc5k. xn — p1ai/activity/356/?nav-news=page-2 [Accessed 6th October 2021])
Об авторах
Наталия Николаевна Вожжова
Аграрный научный центр «Донской»
Автор, ответственный за переписку.
Email: nvozhzh@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-2046-4000
кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник лаборатории маркерной селекции
347740, Российская Федерация, Ростовская обл., г. Зерноград, Научный городок, д. 3Ольга Сергеевна Жогалева
Аграрный научный центр «Донской»
Email: os.zogaleva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1477-3285
младший научный сотрудник лаборатории маркерной селекции
347740, Российская Федерация, Ростовская обл., г. Зерноград, Научный городок, д. 3Натия Темуриевна Купрейшвили
Аграрный научный центр «Донской»
Email: kupreyshvilin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1726-4390
техник-исследователь лаборатории маркерной селекции
347740, Российская Федерация, Ростовская обл., г. Зерноград, Научный городок, д. 3Ангелина Юрьевна Дубина
Аграрный научный центр «Донской»
Email: angel.myshastaja@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1432-7616
техник-исследователь лаборатории маркерной селекции
347740, Российская Федерация, Ростовская обл., г. Зерноград, Научный городок, д. 3Павел Иванович Костылев
Аграрный научный центр «Донской»
Email: p-kostylev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4371-6848
доктор сельскохозяйственных наук, руководитель центра фундаментальных научных исследований
347740, Российская Федерация, Ростовская обл., г. Зерноград, Научный городок, д. 3Список литературы
- Wang F., Wang F., Hu J., Xie L., Yao X. Rice yield estimation based on an NPP model with a changing harvest index // IEEE Journal of Selected Topics in Applied Earth Observations and Remote Sensing. 2020. Vol. 13. Pp. 2953-2959. doi: 10.1109/JSTARS.2020.2993905
- Asibi A.E., Chai Q., Coulter J.A. Rice Blast: a disease with implications for global food security // Agronomy. 2019. Vol. 9. № 8. Р. 451. doi: 10.3390/agronomy9080451
- Yulensri Y., Noveri, Arneti. Efektifitas formulasi cair konsorsium bakteri sebagai pengendali hama dan penyakit pada padi sawah organik // Jurnal Ilmiah Inovasi. 2020. Vol. 20. № 3. Pp. 35-40. doi: 10.25047/jii. v20i3.2366
- El-Abbasi I.H., Khalil A.A., Awad H.M., Shoala T. Nano-diagnostic technique for detection of rice pathogenic fungus Pyricularia oryzae // Indian Phytopathology. 2020. Vol. 73. Pp. 673-682. doi: 10.1007/ s42360-020-00254-7
- Hannum S., Hasibuan U., Sinaga R., Wahyuningsih H. Identification of blast resistance genes in fifteen rice accessions (Oryza sativa L.) from North-Sumatera // IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. 2019. Vol. 305. Р. 012076. doi: 10.1088/1755-1315/305/1/012076
- Nickolas H., Jayalekshmy V.G., Yamini Varma C.K., Vighneswaran V. Molecular and fi level screening for blast resistance gene donors among traditional rice varieties of Kerala // Journal of Tropical Agriculture. 2018. Vol. 56. № 2. Pp. 93-98. URL: http://jtropag.kau.in/index.php/ojs2/article/view/652/463
- Pandian B.A., Joel J., Nachimuthu V.V., Swaminathan M., Govintharaj P., Tannidi S., Sabariappan R. Marker-aided selection and validation of various Pi gene combinations for rice blast resistance in elite rice variety ADT43 // Journal of Genetics. 2018. Vol. 97. Pp. 945-952. doi: 10/1007/s12041-018-0988-7
- Guan H., Hou X., Jiang Y., Srivastava V., Mao D., Pan R., Chen M., Zhou Y., Wang Z., Chen Z. Feature of blast resistant near-isogenic lines using an elite maintainer line II-32B by marker-assisted selection // Journal of Plant Pathology. 2019. Vol. 101. Pp. 491-501. doi: 10.1007/s42161-018-00222-1
- Correa-Victoria F.J., Tharreau D., Martinez C., Vales M., Escobar F., Prado G., Aricapa G. Gene combination for durable blast resistance in Colombia // Fitopatol. Colomb. 2002. Vol. 26. Pp. 47-54. URL: http://ciat-library.ciat.cgiar.org/Articulos_Ciat/poster_riceblast.pdf
- Noenplab A., Vanavichit A., Toojinda T., Sirithunya P., Tragoonrung S., Sriprakhon S., Vongsaprom C. QTL mapping for leaf and neck blast resistance in Khao Dawk Mali105 and Jao Horn Nin recombinant inbred lines // ScienceAsia. 2006. Vol. 32(2). Pp. 133-142. doi: 10.2306/scienceasia1513-1874.2006.32.133
- Jamaloddin M., Durga Rani C.V., Swathi G., Anuradha C., Vanisri S., Rajan C.P.D., Krishnam Raju S., Bhuvaneshwari V., Jagadeeswar R., Laha G.S., Prasad M.S., Satyanarayana P.V., Cheralu C., Rajani G., Ramprasad E., Sravanthi P., Arun Prem Kumar N., Aruna Kumari K., Yamini K.N., Mahesh D., Sanjeev Rao D., Sundaram R.M., Sheshu Madhav M. Marker Assisted Gene Pyramiding (MAGP) for bacterial blight and blast resistance into mega rice variety «Tellahamsa» // PLoS ONE. 2020. Vol. 15(6): e0234088. doi: 10.1371/journal. pone.0234088
- Murray M.G., Thompson W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA // Nucleic Acids Res. 1980. Vol. 8. Pp. 4321-4325. doi: 10.1093/nar/8.19.4321
- Ware D., Jaiswal P., Ni J., Pan X., Chang K., Clark K., Teytelman L., Schmidt S., Zhao W., Cartinhour S., McCouch S., Stein L. Gramene: A resource for comparative grass genomics // Nucleic Acids Res. 2002. Vol. 30. P. 103-105. doi: 10.1093/nar/30.1.103
- Sharma R.C., Shrestha S.M., Pandey M.P. Inheritance of blast resistance and associated microsatellite markers in rice cultivar «Laxmi» // Journal of Phytopatology. 2007. Vol. 155. № 11-12. P. 749-753. doi: 10.1111/j.1439-0434.2007.01298.x
- Мухина Ж.М., Мягких Ю.А., Богомаз Д., Матвеева Т.В, Токмаков С.В. Создание кодоминантного молекулярного ПЦР-маркера для идентификации гена расоспецифической устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-ta // Рисоводство. 2008. № 7. С. 3-4.
Дополнительные файлы
