Оценка микробного разнообразия слепого отдела кишечника цыплят-бройлеров при введении кумарина и кормового антибиотика в рацион

Полный текст

Введение

Одна из актуальных стратегий в противобактериальной терапии связана со способностью некоторых веществ ингибировать межклеточную коммуникацию в бактериальных популяциях, известную, как Quorum sensing (QS) [1—3], так как в этом состоянии бактерии способны формировать биопленки и синтезировать факторы вирулентности и патогенности, которые более устойчивы при воздействии веществ в отличие от планктонных форм [4, 5]. Среди таких веществ можно отметить растительные экстракты, которые способны к прямому подавлению размножения патогенных бактерий и регулированию кишечного микробиома у цыплят-бройлеров [6]. Их антибактериальная активность направлена на широкий спектр микроорганизмов [7—9]. В растительных экстрактах содержится большое количество соединений, но особое внимание следует обратить на фенольные соединения, а в частности, кумарины, роль которых в качестве антимикробных агентов достаточно широко изучена [10]. Они представляют собой ненасыщенные ароматические лактоны, в основе которых лежит 5,6-бензо-α-пирон. Согласно данным [11, 12], антибактериальная эффективность производных кумарина усиливается при гидроксилировании в 6, 7 и 8 положении. Преимущества кумаринов как перспективных антибактериальных соединений: широкий спектр антибактериальной активности; они выделяются растениями в виде фитоалексинов для защиты от атак патогенов; они безвредны для окружающей среды и не подвержены развитию устойчивости у бактерий [12]. Биологический анализ с использованием Chromobacterium violaceum ATCC 31532 [13] подтвердил способность 7,8-дигидрокси-4-метилкумарина ингибировать QS при субингибирующих концентрациях. При этом среди протестированных соединений кумарина и его производных 7,8-дигидрокси-4-метилкумарин был наиболее активным в контексте проводимых исследований.

Еще одной стратегией борьбы с нарушениями микробиоценозов может выступить комбинация кумарина с антибиотиками, что может привести к потенцированному эффекту. Однако вопрос совместного их использования все еще остается малоизученным.

Цель исследования — оценка биоактивности в отношении микробного сообщества кишечника сельскохозяйственной птицы 7,8-дигидрокси-4-метилкумарина, а также комбинации его с тетрациклином.

Материалы и методы исследования

Работа выполнена в соответствии с протоколами Женевской конвенции и принципами надлежащей лабораторной практики (ГОСТ Р 53434—2009). Все процедуры над животными были выполнены в соответствии с правилами Комитета по этике животных ФНЦ БСТ РАН. В исследовании по оценке влияния отдельных веществ антикворума — 7 ,8-дигидрокси-4-метилкумарин (AL63074—8; 7,8-dihydroxy-4-methyl coumarin) (Sigma-Aldrich, USA) и Биовита — 2 0% хлортетрациклина (Сиббиофарм, Россия) и их композиций участвовали цыплята-бройлеры. Птица, участвовавшая в исследовании, была выращена до 42-дневного возраста и разделена на 4 экспериментальные группы по 15 особей в каждой (кросс Арбор Айкрес). Контрольная группа получала рацион без добавок (основной рацион (OP)); I экспериментальная группа (положительный контроль) получала OР + Биовит — 2 0% хлортетрациклин в дозировке 0,63 г/кг живой массы в сутки (ж. м./сут); II экспериментальная группа получала ОР + 7,8-дигидрокси-4-метилкумарин в дозе 9,0 мкг/кг ж. м./сут; III опытная группа — O P + 7,8-дигидрокси-4-метилкумарин + Биовит — 2 0% хлортетрациклин.

Состав основного рациона,%: пшеница —  48; ячмень —  2,7; кукуруза —  7,6; соевый шрот (46 % CP) —  25,5; подсолнечный шрот (38 % CP) —  7,4; подсолнечное масло —  5,1; дикальцийфосфат —  1,7; мел кормовой —  1,0; известняк —  0,6; соль —  0,4; DL-метионин —  0,19; L-Лизин —  0,36; бикарбонат натрия —  0,12; витаминно-минеральный премикс — 2 ,1 (7—28-дневный возраст; далее проводилась корректировка состава рациона).

Декапитацию птицы проводили под нембуталовым эфиром на 42-е сутки эксперимента. Отбор проб содержимого слепых отростков толстого отдела кишечника для анализа микрофлоры проводили после убоя птицы в пробирки типа Эппендорф (Eppendorf, Germany). Тотальную ДНК из образцов содержимого кишечника выделяли при помощи набора Fast DNA® SPIN Kit for Faeces (MP Biomedicals Inc., Solon, OH, USA) с использованием лизирующего матрикса Lysing Matrix E. Образцы гомогенизировали на приборе Tissue Lyser LT (Qiagen, Venlo, Netherlands). Приготовление ДНК-библиотек выполнено в соответствии с протоколом Illumina (Part #15044223, Rev. B.). Секвенирование ампликоновых ДНК-библиотек было выполнено на платформе Illumina MiSeq с использованием набора реактивов MiSeq Reagent Kitv.2 (500-cycle) (Illumina, SanDiego, CA, USA). Приготовление ДНК-библиотек, секвенирование и биоинформатическая обработка проведены в ЦКП «Персистенция микроорганизмов» Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (Оренбург, Россия).

Результаты исследования и обсуждение

При изучении микробиоты кишечника идентифицированы операционные таксонобразующие единицы (ОТЕ), относящиеся к домену Bacteria. Количество идентифицируемых филумов и ОТЕ варьировало для каждого образца (табл.).

Характеристика разнообразия микробных сообществ  слепого отдела кишечника цыплят-бройлеров

Группа	Количество прочтений	ОТЕ	Количество филумов
Контроль	29923	326	4
I	19540	293	5
II	22824	291	5
III	24740	323	5

Characterization of the diversity of microbial communities in cecum of broiler chickens

Group	Number of reads	ОТU	Number of phyla
Control	29923	326	4
I	19540	293	5
II	22824	291	5
III	24740	323	5

Микробиом слепого отдела кишечника цыплят-бройлеров на уровне филума, семейств и родов в процентном соотношении приведен на рис., А, Б и В соответственно.

Анализ бактериального профиля содержимого кишечника контрольной группы представлен 4 филумами, среди которых преобладает Firmicutes (86,1 %), доля остальных групп была менее 10 % —  Actinobacteria (4,65 %), Proteobacteria (4,47 %) и Bacteroidetes (4,18 %), а остальных, не классифицируемых, филумов составляет не более 0,6 % от общего количества.

Преобладающее количество выделенных бактерий филума Firmicutes относилось к классу Clostridia (58,84 %), в котором следует выделить наиболее многочисленное семейство Ruminococcaceae (37,38 %), участвующее в расщеплении крахмала, содержащегося в кукурузе и пшенице —  компонентах основного рациона. Данные бактерии производят короткоцепочечные жирные кислоты, в основном пропионат и ацетат, благодаря чему защищают кишечник от воспаления [6]. В этом семействе значимую долю составляли unclassified_ Ruminococcaceae (21,44 %) и род Faecalibacterium (5,39 %). Другое семейство данного класса —  Lachnospiraceae (15,47 %), при этом значимыми в нем оказались рода Eisenbergiella и Mediterraneibacter, доля которых составляла 4,94 и 3,29 % соответственно, содержание неклассифицированного рода — 4 ,53 %. Бактерии данного кластера поддерживают и регулируют функции кишечного эпителия [14], а также разлагают растительные материалы и производят бактериоцины, продуцируют короткоцепочечные жирные кислоты — б утират и лактат — в  результате процессов ферментации [15]. Таким образом, несколько исследований свойств и функций этих родов бактерий показали, что эти микроорганизмы могут быть полезны в качестве пробиотиков для домашней птицы [16]. Поскольку вегетативные клетки данных бактерий обладают высокой чувствительностью к кислороду, эти бактерии одними из первых исчезают из микробиоты кишечника при воспалительных заболеваниях за счет продукции активных форм кислорода макрофагами и гранулоцитами [17, 18]. Таким образом, в большинстве случаев уменьшение количества Lachnospiraceae является не причиной воспаления, а его следствием [19].

Следующий класс Bacilli (18,66 %), в котором стоит отметить семейство Streptococcaceae (11,39 %), идентифицированное единственным родом Streptococcus, обычно определяемым в кишечнике в относительно низком содержании, обладает потенциалом к избыточному росту при различных патологических состояниях [20], при этом в опытных группах содержание этих бактерий было ниже (в I группе на 11,2 %, во II —  на 10,69 %, в III —  на 11,17 %). Следующим по численности семейством данного класса является Lactobacillaceae (7,18 %), к нему относится род Lactobacillus (4,21 %). Наименьший весомый процент содержания характерен для класса Erysipelotrichia (7,59 %) с лидирующим родом Turicibacter (6,20 %) семейства Erysipelotrichaceae (7,59 %). Представители Tuicibacter непосредственно контактируют с клетками хозяина и принимают участие в воспалительных и неопластических процессах [21]. Филумы Actinobacteria и Proteobacteria менее разнообразны, значимыми родами в них являются род Rubneribacter (4,33 %) семейства Eggerthellaceae (4,65 %) и род Bilophila (3,43 %) семейства Desulfovibrionaceae (3,47 %) соответственно. В нашем исследовании происходило снижение числа представителей Proteobacteria во всех опытных группах (в I —  на 2,25 %, во II — на 3,55 %, в III —  на 2,63 %).

Исследование содержимого слепого кишечника бройлеров позволило выявить определенные изменения в опытных группах. Доминирующее место в структуре микрофлоры занимали два типа: Firmicutes и Bacteroidetes первый филум составлял в группах 69…86 % (от общего содержания), что соответствует ряду исследований [22, 23]. Наибольшую долю в микробиомах опытных групп составляло семейство Ruminococcaceae, относящееся к типу Firmicutes и классу Clostridia, это важная группа микроорганизмов, которая является нормальной флорой кишечника и участвуют в обмене веществ, расщепляя клетчатку растительных кормов (целлюлоза, гемицеллюлоза, пектин, лигнин) до летучих жирных кислот, как упоминалось выше [24, 25].

В I группе было выявлено 296 ОТЕ, принадлежащих к 5 филумам (рис.), при этом так же лидировал филум Firmicutes (82,3 %), а содержание филума Bacteroidetes (14,28 %) увеличилось на 10,10 % по сравнению с контролем, на долю оставшихся Proteobacteria и Actinobacteria приходилось менее 10 % от общего числа (2,22 и 0,86 % соответственно). Таксономическое разнообразие филума Firmicutes схоже с контролем, так класс Clostridia (66,53 %) представлен семействами Ruminococcaceae (39,86 %), в котором максимальный процент составляет неклассифицированная группа (18,28 %), родом Faecalibacterium (3,79 %) с незначительно снизившейся численностью (на 2 %) и родом Monoglobus (5,03 %) с возросшей на 5 % численностью по сравнению с контролем. Содержание другого семейства Lachnospiraceae (7,64 %) снизилось в 2 раза, так же, как и его родовое разнообразие, здесь можно выделить только неклассифицированную группу (3,51 %). Помимо этого повысилось и разнообразие семейств в данном филуме, что подтверждается повышением в 2 раза содержания таких семейств, как Peptostreptococcaceae (3,76 %) и Catabacteriaceae (3,34 %), в качестве единственных представителей выступают рода Romboutsia и Catabacter соответственно. Значительная доля данного класса не была идентифицирована и составила 10,80 % от общего числа. При добавлении в основной рацион кормовой добавки для данного филума отмечается значительное снижение —  в 8,48 раза по сравнению с контрольной группой —  класса Bacilli (2,20 %) и его представителей Lactobacillaceae (2,07 %) и Streptococcaceae (0,19 %). Это согласуется с рядом исследований [26, 27], что обилие Lactobacillus в кишечнике уменьшалось после применения антибиотика. При этом зафиксировано и увеличение почти в 2 раза численности класса Erysipelotrichia (12,89 %), в котором было так же, как и в контрольной группе, выделено единственное семейство Erysipelotrichaceae с первенствующим представителем —  родом Turicibacter (12,43 %). При этом данный таксон может, как уже отмечалось, вызывать дисбиотические изменения в кишечнике птиц [28].

Второй филум представлен единственным классом Bacteroidia (14,28 %) с семейством Bacteroidaceae (8,81 %), известным способностью ферментировать клетчатку и крахмалистые компоненты кормов, с доминирующим родом Phocaeicola (8,63 %), превышающим уровень контрольного значения в 8,46 раз, и семейством Rikenellaceae (5,45 %) с родом Alistipes, так же превосходящим контроль в 1,85 раз. Bacteroidaceae вместе с грамположительными Lachnospiraceae и Ruminococcaceae представляют наиболее распространенную семейную характеристику слепой кишки кур [29]. Оставшиеся идентифицированные филумы малочисленны и доля представленных родов —  менее 3 %.

Микробиом слепого отдела кишечника цыплят-бройлеров  на уровне филума (А), семейств (Б) и родов (В)
Microbiome of cecum of broiler chickens at the level of phylum (A), families (B) and genera (C)

Среди идентифицированных 291 ОТЕ во II опытной группе доминирующее положение занимали также филумы Firmicutes (69,29 %) и Bacteroidetes (27,33 %) (см. рис.), причем содержание изменялось уменьшением первого на 16,81 % и увеличением второго на 23,15 % относительно контроля, что коррелирует с результатами исследования [30], в которых при добавлении в рацион кумарина данные филумы были доминирующими типами и наблюдалось увеличение доли микроорганизмов, относящихся к Bacteroidetes, на фоне снижения бактерий Firmicutes. Оставшиеся филумы в данной группе составили менее 10 % от общего объема.

Таксономическое разнообразие филума Firmicutes схоже с контролем, но менее разнообразно относительно I группы. В первом таксоне так же лидирующие позиции занимает класс Clostridia (55,56 %), в котором большой процент составляют семейство Ruminococcaceae (37,05 %) и семейство Lachnospiraceae (10,41 %). При этом их доля незначительно уменьшилась по сравнению с контролем, а среди их представителей наибольшая численность характерна для неклассифицированных родов. Также для семейства Ruminococcaceae стоит отметить род Subdoligranulum  (4,90 %), превышающий контроль в 2,86 раза, I группу — в  2,19, а III — в  1,6, и род Faecalibacterium (4,59 %), изменения которого в группах незначительны. Стоит отметить и семейство Catabacteriaceae (3,05 %) с единственным идентифицированным родом Catabacter, численность которого не отличается от опытных групп, но превышает в 2,11 раза контроль.

Еще одним доминирующим классом в данном филуме Firmicutes является Bacilli (12,54 %), при этом его содержание повысилось в 1,64, также как и таксономическое разнообразие семейства Lactobacillaceae (11,78 %), по сравнению с контролем, в котором численность составляла 7,18 %. Рода этого семейства составляли примерно одинаковую долю —  Lactobacillus (4,53 %), Ligilactobacillus (4,19 %), Limosilactobacillus (3,05 %).

При введении в рацион кумарина во втором упомянутом филуме произошла смена лидера и в большей степени он был представлен семейством Rikenellaceae, с единственным обнаруженным представителем Alistipes (22,15 %), содержание которого в 4 раза превышает показатель I группы и в 7,5 раз контроль. По численному соотношению семейств в исследованиях, приведенных выше [31], было так же отмечено, что доминирующими семействами были Bacteroidaceae, Rikenellaceae, представленные в порядке убывания. Эти данные подтверждают наши исследования, за исключением порядка следования —  Ruminococcaceae, Rikenellaceae, Bacteroidaceae.

При дальнейшем таксономическом анализе для III опытной группы были классифицированы 323 ОТЕ, соотношение филумов схоже с контролем Firmicutes (88,73 %), Bacteroidetes (5,14 %), Actinobacteria (3,59 %), Proteobacteria (1,84 %) (см. рис.). Привлекает внимание меньшее таксономическое разнообразие при добавлении тестируемой кормовой добавки в рацион. В первом филуме прослеживается та же динамика, как и в предыдущих группах, лидером является класс Clostridia (81,00 %), причем для этой группы отмечены его максимальное содержание среди всех, разница с контролем составляет 22,16 %, и те же доминирующие семейства Ruminococcaceae (57,97 %) и Lachnospiraceae (7,94 %). Для первого семейства стоит отметить увеличение разнообразия родов —  Faecalibacterium (3,48 %), Butyricicoccus (3,39 %) и Subdoligranulum (3,02 %), при этом большую долю составили неклассифицированные виды (38,53 %). Тенденция увеличения численности семейства Catabacteriaceae (3,03 %) с родом Catabacter (3,03 %) сохраняется и для данной опытной группы и его содержание превышает контроль в 2 раза. Весьма большую долю класса Clostridia составляет неклассифицированное семейство (10,39 %). В филуме Firmicutes также стоит отметить снижение содержания рода Lactobacillus (3,31 %) класса Bacilli (4,46 %). Согласно исследованиям [33] тетрациклин снижал уровень Lactobacillales, что отмечено и в нашей работе. При включении в рацион Биовита содержание Lactobacillus уменьшилось в 8,9 раз (I группа), а при комбинации его с кумарином — в  4,25 раза (III группа) в сравнении со значением контрольной группы.

Второй по численности филум Bacteroidetes (5,14 %) представлен семейством Rikenellaceae (3,23 %), с единственным идентифицированным родом Alistipes (3,23 %), и в меньшей степени семейством Bacteroidaceae (1,84 %).

Заключение

Группу облигатных микроорганизмов, колонизирующих слепую кишку кур, составляют семейства Ruminococcaceae и Lachnospiraceae, за которыми следуют Lactobacillaceae и Erysipelotrichaceae. Антибактериальный эффект Биовита, как самостоятельно, так и в совокупности с производным кумарина, оказал влияние на численность Lactobacillaceae и Lachnospiraceae. При добавлении 7,8-дигидрокси-4-метилкумарина и Биовита в рацион наблюдается снижение более чем на 10 % содержания условно-патогенной флоры Streptococcus. Таким образом, анализируемые вещества: 7,8-дигидрокси-4-метилкумарин и Биовит —  20% хлортетрациклин — в рационах бройлеров оказали влияние на формирование микробного состава кишечника. Это исследование расширяет знания о роли тестируемых веществ.

Об авторах

Галимжан Калиханович Дускаев

Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: gduskaev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9015-8367

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник отдела кормления с/х животных и технологии кормов, заместитель директора

Российская Федерация, 460000, г. Оренбург, ул. 9 Января, д. 29

Кристина Сергеевна Лазебник

Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий Российской академии наук

Email: christinakondrashova94@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4907-9656

младший научный сотрудник лаборатории молекулярно-генетических исследований в животноводстве

Российская Федерация, 460000, г. Оренбург, ул. 9 Января, д. 29

Татьяна Андреевна Климова

Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий Российской академии наук

Email: klimovat91@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4298-1663

научный сотрудник лаборатории микробиологии

Российская Федерация, 460000, г. Оренбург, ул. 9 Января, д. 29

Список литературы

Дополнительные файлы