Морфофункциональные показатели иммунной системы цыплят при диссеминации бактерий Pseudomonas aeruginosa

Полный текст

Введение

В птицеводческих хозяйствах при высоких показателях заболеваемости и смертности наиболее часто выявляют поражения органов дыхания, сердечно-­сосудистой системы, резкое снижение яйценоскости [1–3]. При массовой гибели эмбрионов, развитии септицемии, геморрагической пневмонии цыплят достоверно часто выделяли изоляты Pseudomonas aeruginosa [4–7]. Во всем мире наблюдается тенденция статистически достоверного возрастания инцидентности эпидемиологических показателей нозокомиального псевдомоноза [8, 9]. Из-за возрастания этиологической значимости при развитии гнойно-­септических процессов млекопитающих и птиц эти бактерии признаны приоритетными для исследований и включены в глобальный список патогенов (Global Priority Pathogen list) множественной лекарственной устойчивости (Multidrug-­Resistant) [10]. Патогенез синдрома избыточного роста патогенных микроорганизмов обеспечивается диссоциацией, дисперсией некультивируемых клеток, имеющих преимущества при гиперагрегации многоклеточной гетерогенной популяции биопленок [3, 11]. Для разработки эффективных методов диагностики и превентивных противоэпизоотических мероприятий приоритетными задачами являются раскрытие патогенетических механизмов адаптации убиквитарных микроорганизмов к длительной персистенции как in vivo, так in vitro.

Цель исследования — анализ динамики морфофункциональных показателей иммунной системы цыплят при диссеминации бактерий Pseudomonas aeruginosa.

Материалы и методы исследования

Микроорганизмы Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 культивировали в жидких и плотных питательных средах: Nutrient broth (HiMedia, India), Difco Bacto agar (Difco, USA), Cetrimide agar (HiMedia, India) при 37±1 °C в течение 24 и 48 ч. Биохимические свой­ства изучали с применением среды Гисса. Для исследования бактериологических и морфофункциональных показателей 20-суточным цыплятам породы Белый леггорн (n = 10) интраназально вводили по 0,02 см³ культуры микроорганизмов P. aeruginosa (5×10⁹ КОЕ/мл) — опыт; аналогичной группе цыплят (n = 10) вводили тем же способом 0,02 см³ 0,85%-го NaCl — контроль. Патологоанатомические вскрытия и гистологические исследования проводили общепринятыми методами, учитывая анатомо-­топографические особенности органов птицы [1, 2, 12–14]. Для исследований динамики изменений при диссеминации микроорганизмов учитывали проницаемость сосудов легких по степени экстравазации витального красителя Эванса [3, 11]. Опыты проводили соответственно требованиям «Директива 2010/63/ЕС Европейского парламента и Совета Европейского союза» от 22 сентября 2010 г. о защите животных, используемых в научных целях. Результаты экспериментальных исследований обрабатывали общепринятыми методами и считали достоверными при р ≤ 0,05.

Результаты исследований и обсуждение

Клинические признаки острого течения болезни развивались в течение 24…120 ч экспериментальных исследований. Наблюдали анорексию, жажду, цианоз сережек, гребня, из носовых отверстий выделялась кровянистая пенистая жидкость, перьевой покров периорбитальной области и вокруг носовых отверстий слипшийся и влажный. При бактериологическом исследовании патматериала изоляты были выделены через 24…48 ч из легких, кишечника, печени; 96 ч — крови, почек; 120 ч — селезенки. Изоляты были грамотрицательные, аэробные, восстанавливали нитриты в нитраты, разжижали желатин и свернутую кровяную сыворотку, гидролизовали казеин, не ферментировали мальтозу, не образовывали индол, сероводород (таблица).

Результаты изучения фенотипических признаков изолятов, выделенных из патматериала цыплят

Признаки	Изоляты, 37 ± 1 °C
	№ 1	№ 2	№ 3	№ 4	№ 5	№ 6
Оксидаза	+	+	+	+	+	+
Каталаза	+	+	+	+	+	+
Глюкоза	+	+	+	+	+	+
Лактоза	–	–	–	–	–	–
Сахароза	–	–	–	–	–	–
Мальтоза	–	–	–	–	–	–
Маннитол	+	+	+	+	+	+
Трегалоза	+	+	+	+	+	+
Ксилоза	+	+	+	+	+	+
Арабиноза	+	+	+	+	+	+
β-галактозидаза	–	–	–	–	–	–
Малонат	+	+	+	+	+	+
Уреаза	+	+	+	+	+	+
Аргинин	+	+	+	+	+	+
Орнитин	–	–	–	–	–	–
Лизин	–	–	–	–	–	–
Ацетамид	+	+	+	+	+	+
Эскулин	–	–	–	–	–	–
Инозитол	–	–	–	–	–	–
Индол	–	–	–	–	–	–
Сероводород	–	–	–	–	–	–
Гемолиз	+	+	+	+	+	+
Диффундирующий сине-зеленый пигмент	+	+	+	+	+	+

Примечание. № 1 — из легких; № 2 — из крови; № 3 — из печени; № 4 — из почки; № 5 — из содержимого подвздошного кишечника; № 6 — из содержимого слепого кишечника.

Диссеминация бактерий сопровождалась множественными кровоподтеками покровов кожи, признаками гемодинамических расстройств сердечно-­сосудистой, дыхательной, пищеварительной, выделительной, репродуктивной систем. Выявляли воспалительную гиперемию, серозный отек, лимфоидно-­макрофагальную инфильтрацию некроз и десквамацию покровного эпителия слизистой оболочки трахеи. Значительные скопления густой слизи и наличие пленок фибрина выявляли в просвете спавшихся воздухоносных мешков. При наличии признаков аэросаккулита и острой катаральной пневмонии воспалительные процессы сопровождались образованием серозно-­геморрагического экссудата, десквамацией альвеолярного эпителия. Выявляли пропитывание тканей легкого синим красителем Эванса, не проникающего через неповрежденный эндотелий кровеносных сосудов. Коэффициент проницаемости кровеносных сосудов К при экстравазации витального красителя: К_{контроль} — ≤ 0,18; К_опыт — 1,08 ± 0,11 — 2,04 ± 0,12. Пораженные дольки легких имели дряблую консистенцию, были окрашены в ярко красный цвет, поверхность разреза органа была влажной. Значительные скопления геморрагического экссудата и светло-­розовые нитевидные структуры фибрина выявляли в просвете парабронхов, бронхов и альвеол. В междольковой соединительной ткани наблюдали гиперемию и лейкоцитарную инфильтрацию, пролиферацию фибробластов. Перикард был заполнен серозно-­фибринозным экссудатом, обширные кровоизлияния с кровоподтеками выявлялись под эндокардом. Признаки острой дилатации правого предсердия и переполнение правого желудочка жидкостью темно-­красного цвета сопровождались кардиомиопатией. При развитии застойной гиперемии коронарных сосудов развивались признаки токсической дистрофии кардиомиоцитов, массовый распад лимфоцитов и диссеминированный тромбоз.

В просвете тонкого отдела кишечника выявляли скопление жидкости коричневого цвета с кровяными сгустками, множественные точечные, пятнистые и полосчатые кровоизлияния выявляли в слизистой оболочке желудка и тонкого кишечника. Выявляли дискомплексацию балочной структуры долек, токсическую дистрофию гепатоцитов, кровенаполнение синусоидных капилляров. Развивался застойный геморрагический инфаркт почек, атрезия яйцевых фолликулов и яйцеводов, желточные перитониты. Как правило, развивались признаки геморрагического диатеза, катарально-­геморрагического аэросаккулита, геморрагической пневмонии, серозно-­фибринозного перикардита, некроза миокарда и печени, септицемии, разрыва желтков, спленомегалии (рис. 1).

Рис. 1. Абсолютная масса селезенки цыплят при интраназальном заражении бактериями Pseudomonas aeruginosa, 5×10⁹ КОЕ/мл
Источник: выполнили Е.М. Ленченко, Г.С. Толмачева с помощью Microsoft Word

В целом инициация и развитие патогенетических механизмов опосредованы снижением фагоцитарной функции лейкоцитов, секрецией белков острой фазы и цитокинов, развитием септицемии и гнойно-­воспалительных процессов. При длительной персистенции микроорганизмов развивались признаки акцидентальной трансформации тимуса, атрофии бурсы Фабрициуса, гиперплазии клеток эзофагальных фолликул, дивертикула Меккеля тощей кишки, слепокишечных лимфоидных фолликул, селезенки. Достоверно часто в участках опустошения красной пульпы наблюдался кариолизис эритроцитов и оксифильные включения зернистой формы выявлялись в цитоплазме эритроцитов. Развитие патологических процессов по типу реакции гиперчувствительности замедленного типа сопровождалось бактериальной эмболией сосудов, крупноклеточной гиперплазией лимфаденоидной ткани, увеличением числа гистиоцитов, мегакариоцитов. Выявляли участки лизиса эритроцитов и скопления диффузно расположенных гранул гемосидерина в паренхиме селезенки и просвете сосудов (рис. 2).

Рис. 2. Селезенка цыпленка при заражении бактериями P. aeruginosa. Гематоксилин и эозин. Ок. 10, об. 20, H604 Trinocular Unico, USA
Источник: выполнили Е.М. Ленченко, Г.С. Толмачева

Установлено увеличение относительной площади красной пульпы и уменьшение относительной площади белой пульпы. Наблюдалось увеличение общей площади реактивных центров белой пульпы. В участках уплотнения и воспаления кооперативное взаимодействие лейкоцитов было представлено преимущественно популяцией В-лимфоцитов и макрофагов. Отмечены прямые коррелятивные зависимости (r = 0,89) между показателями увеличения числа Thl-лимфоцитов и гиперсекрецией иммуноглобулинов. Установлено достоверное увеличение размеров лимфоидных фолликул, лимфоциты вокруг центральной артерии располагались разреженно, наблюдался пикноз и кариорексис лимфоцитов, некроз реактивных центров. Как правило выявлялись участки опустошения синусов, гигантские макрофаги, развивались признаки периваскулярной ретикулоэндотелиальной гиперплазии.

Общие закономерности антигенного воздействия опосредованы реакцией центральных органов иммунной системы, призванных «рекрутировать» лимфоциты, и периферических органов — формировать микроокружение участков межклеточных взаимодействий иммунокомпетентных клеток [15–18]. При скрининге образцов, в т. ч. и объединенных проб разных возрастных групп популяции следует учитывать, что максимальный уровень специфических иммуноглобулинов наблюдается через 1…4 недели [1, 3]. Наряду с применением химиотерапевтических препаратов и средств специфической профилактики рекомендуется применение препаратов для коррекции иммунного статуса [19–22]. Превентивная мера снижения рисков формирования и поддержания природных очагов инфекций — оптимизация схемы микробиологического мониторинга для выявления общих закономерностей развития эпизоотического процесса при циркуляции патогенов в естественных экосистемах без воздействия антропогенных факторов [13, 14, 16]. Методологические подходы разработки и внедрения научно обоснованных принципов профилактики в промышленном птицеводстве основаны на совершенствовании нормативной правовой базы, адаптации методов экономической оценки эффективности мероприятий, использовании цифровых технологий, в т. ч. для планирования и реализации противоэпизоотических мероприятий [19, 20, 23].

Заключение

При диссеминации бактерий P. aeruginosa в ткани и органы цыплят установлено достоверное увеличение показателей экстравазации кровеносных сосудов легкого, опыт — К ≥ 2,04. Инициация и развитие патогенетических механизмов опосредованы развитием иммунных реакций по типу гиперчувствительности замедленного типа: бактериальной эмболией сосудов, крупноклеточной гиперплазией лимфаденоидной ткани, увеличением числа гистиоцитов, мегакариоцитов.

Об авторах

Екатерина Михайловна Ленченко

Российский биотехнологический университет (РОСБИОТЕХ)

Автор, ответственный за переписку.
Email: lenchenko.ekaterina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2576-2020
SPIN-код: 9417-0889

доктор ветеринарных наук, профессор, кафедра ветеринарной медицины, институт ветеринарии, ветеринарно-санитарной экспертизы и агробезопасности

Российская Федерация, 125080, г. Москва, Волоколамское ш., д. 11

Галина Сергеевна Толмачева

Федеральный научный центр пищевых систем им. В.М. Горбатова

Email: tgs2991@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9937-320X
SPIN-код: 6909-2048

инженер-исследователь

Российская Федерация, 109316, г. Москва, ул. Талалихина, д. 26

Евгений Владимирович Куликов

Российский университет дружбы народов

Email: kulikov-ev@rudn.ru
ORCID iD: 0000-0001-6936-2163
SPIN-код: 6199-2479

кандидат биологических наук, доцент, доцент департамента ветеринарной медицины

Российская Федерация, 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6

Список литературы

Дополнительные файлы