Гематологические показатели крыс при применении кормовой добавки Protigen

Полный текст

Введение

Мочевина представляет собой соединение небелкового азота, которое может быть использовано для обеспечения разлагаемого белка в рубце в рационах жвачных животных [1, 2]. В связи с невысокой стоимостью мочевины, ее использование в качестве неполной замены источников растительного белка вызывает повышенный интерес. Однако в животноводстве использование мочевины в питании сельскохозяйственных животных уменьшено из-за ее распада до аммиака в рубце, превышающего скорость ферментации углеводов. Асинхронность между выработкой аммиака в рубце и доступной ферментируемой энергией может оказывать негативное влияние на эффективность синтеза микробного сырого протеина, что приводит к уменьшению объема оттока микробного сырого протеина, и, как следствие, к ухудшению доступности метаболизируемого белка для производства молока [3—5]. Быстрый распад мочевины в рубце может снизить эффективность использования азота, ускорив его выведение, повысить концентрацию аммиака в крови, увеличив риск его токсичности [6, 7]. В целях устранения сложностей, возникающих при использовании мочевины кормового качества, для разработки продуктов с более медленным высвобождением мочевины используют технологии нанесения специального покрытия, которое может контролировать разложение мочевины и выделение аммиака в рубец, что положительно влияет на синхронизацию выработки аммиака в рубце с усвоением энергии и уменьшает метаболические затраты [8].

Одна из обработанных форм мочевины — специальная добавка Protigen —представляет собой концентрированную азотосодержащую фракцию рациона, являющуюся источником небелкового азота для сельскохозяйственных животных, благодаря которой жвачные животные могут употребить больше энергии и клетчатки в сухом веществе рациона [9].

Модификация схем кормления путем введения в рацион животного дополнительных кормовых добавок может приводить к изменениям гематологических показателей. Кровь выполняет важные функции в организме животных, такие как обеспечение обмена веществ, гормональная регуляция и морфофункциональное состояние организма, а также является внутренней средой организма и отражает физиологическое состояние в зависимости от факторов внешней среды, в том числе условий содержания и кормления [10, 11].

Имеющиеся результаты научных исследований биологических эффектов применения Protigen недостаточно отражают влияние введения в рацион животных данной кормовой добавки на параметры крови [12—14]. В связи с этим возникает необходимость исследования биологических эффектов кормовой добавки Protigen на гематологические показатели.

Доклинические исследования влияния изучаемой добавки на общий анализ крови не проводили, однако имеются научные публикации по применению аналогов, одним из которых является кормовая добавка Оптиген. В исследовании эффектов применения добавки показано влияние ее введения в рацион крупного рогатого скота на гематологические показатели животных.

Цель исследования — изучение гематологических показателей крыс в условиях применения кормовой добавки Protigen.

Материалы и методы исследования

В рамках выполнения НИР по теме «Изучение токсикологических свой­ств кормовой добавки Protigen на лабораторных животных» проведены исследования гематологии как части общей проблемы, характеризующей безопасность и эффективность введения кормовой добавки Protigen в рацион жвачных животных. Исследования проводили на 50 аутбредных крысах (♀) массой 190…210 г на базе Санкт-­Петербургского государственного университета ветеринарной медицины.

Лабораторные животные имели круглосуточный свободный доступ к корму и воде. Содержание лабораторных животных соответствовало рекомендуемой нормативной документации ^[1]. В помещении содержания крыс поддерживался особый микроклимат: температура окружающего воздуха — 18…22 °C; относительная влажность — 50…60 %; автоматическая смена 12‑часового светового периода (06.00–18.00 — день, 18.00–06.00 — ночь); 100 % вентилирование без рециркуляции со сменой воздуха 7…12 объемов комнаты в час.

Лабораторных животных размещали в поликарбонатных клетках на подстиле площадью 2150 см²: по 5 крыс на клетку. В качестве подстила использовали опилки деревьев нехвой­ных пород, стерилизованные в сухожаровом шкафу производства Binder. Для кормления животных использовали комбикорм полнорационный для лабораторных животных ЛБК‑120 (Тосненский комбикормовый завод), соответствующий ГОСТу 34566-2019 ^[2]. Профильтрованная водопроводная вода давалась в стандартных автоклавированных поилках.

Животные были распределены на три группы: первая и вторая — ежедневно в течении 90 дней получали перорально кормовую добавку в дозе 1/5 от максимальной переносимой (1000 мг/кг массы тела) и 1/10 от максимальной переносимой (500 мг/кг массы тела) соответственно, третья (контрольная) — не получала кормовую добавку. У лабораторных животных регистрировали гематологические показатели через 90 дней включения в рацион кормовой добавки (91‑й день эксперимента) и через 10 дней после прекращения дачи кормовой добавки (101‑й день эксперимента).

Взятие крови проводили методом декапитации в пробирки с ЭДТА. Оценку гематологических показателей осуществляли путем проведения общего анализа крови на гематологическом анализаторе Micros 60.

Дополнительно на протяжении всего исследования оценивали общее состояние животных (особенности их поведения, интенсивность и характер двигательной активности, наличие и характер судорог, координацию движений, тонус скелетных мышц, реакцию на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители, частоту и глубину дыхательных движений, ритм сердечных сокращений, состояние шерстного и кожного покрова, окраску слизистых оболочек, размер зрачка, положение хвоста, количество и консистенцию фекальных масс, окраску мочи, потребление корма и воды, изменение массы тела) ^[3].

Статистическую обработку данных определяли по группам после предварительного определения нормальности распределения данных по критерию Шапиро — Уилка. Учитывая результаты проверки на нормальность распределения данных, использовали критерий Манна — Уитни.

Результаты исследований и обсуждение

Ежедневное пероральное введение кормовой добавки Protigen в течение
90 дней, как и через 10 дней после прекращения дачи кормовой добавки, независимо от дозировки не привело к статистически значимым различиям значений гематологических показателей крови крыс опытных группы относительно контрольной, при этом все исследуемые показатели оставались в пределах физиологической нормы (табл. 1, 2). Однако, через 90 дней непрерывной дачи исследуемой кормовой добавки в дозе 1000 мг/кг массы тела отмечалась тенденция к увеличению абсолютного числа эритроцитов, лейкоцитов в 1,27 раз и процентного содержания палочкоядерных нейтрофилов в 2,25 раз относительно данных показателей в крови животных контрольной группы. Через 10 дней после прекращения применения кормовой добавки содержание лейкоцитов и эритроцитов в крови крыс опытной группы 1 максимально приближается к значению этих показателей в контрольной группе, при этом разница в значении процентного содержания палочкоядерных нейтрофилов уменьшается и составляет 1,75. Также после прекращения дачи кормовой добавки в дозе 1000 мг/кг массы тела установлена тенденция к снижению процентного содержания моноцитов в 2,86 раза относительно контроля.

Таблица 1
Влияние применения кормовой добавки Protigen на гематологические показатели крыс опытной группы 1 и контрольной группы на 91‑й и 101‑й день исследования

Показатель	91‑й день			101‑й день
	Группа 1 (n = 10)	Контрольная группа (n = 5)	P	Группа 1 (n = 10)	Контрольная группа (n =5)	P
	M ± SEM	M ± SEM		M ± SEM	M ± SEM
Гематокрит, л/л	54,4 ± 1,8	53,0 ± 1,2	0,4005	54,4 ± 1,7	54,8 ± 1,0	0,9155
Гемоглобин, г/л	103,8 ± 2,3	117,0 ± 3,0	0,2219	108,6 ± 4,0	113,6 ± 4,3	0,1732
Лейкоциты, 109/л	11,6 ± 0,6	9,1 ± 1,4	0,2101	12,1 ± 1,3	12,3 ± 1,6	1,0
Лимфоциты, %	69,0 ± 2,2	72,0 ± 3,8	0,9166	69,0 ± 5,4	63,8 ± 2,2	0,1732
Моноциты, %	2,8 ± 0,6	2,4 ± 0,6	0,6644	1,4 ± 0,6	4,0 ± 0,5	0,2289
Нейтрофилы палочкоядерные, %	1.8 ± 0,5	0,8 ± 0,4	0,1544	1,4 ± 0,2	0,8 ± 0,6	0,2282
Нейтрофилы сегментоядерные, %	26,0 ± 2,2	24,6 ± 3,7	0,9163	27,4 ± 4,9	28,0 ± 2,4	0,5309
СОЭ, мм/ч	0,5 ± 0,0	0,5 ± 0,0	0,8808	0,4 ± 0,0	0,4 ± 0,0	0,4189
Тромбоциты, 109/л	211,0 ± 10,8	188,0 ± 10,3	0,2073	179,2 ± 8,4	210,4 ± 18,4	0,1161
Эозинофилы,%	0,4 ± 0,2	0,2 ± 0,2	0,6005	0,8 ± 0,5	0,4 ± 0,2	0,722
Эритроциты, 1012/л	8,4 ± 0,9	6,6 ± 0,2	0,1437	7,0 ± 0,8	6,6 ± 0,1	0,8345

Источник: выполнила Л.И. Сабирзянова.

Table 1
Effect of Protigen feed additive on hematological parameters of rats in experimental group 1 and control group on the 91st and 101st day of the experiment

Indicator	91 days			101 days
	Group 1 (n = 10)	Control group (n = 5)	P	Group 1 (n = 10)	Control group (n = 5)	P
	M ± SEM	M ± SEM		M ± SEM	M ± SEM
Hematocrit, l/l	54.4 ± 1.8	53.0 ± 1.2	0.4005	54.4 ± 1.7	54.8 ± 1.0	0.9155
Hemoglobin, g/l	103.8 ± 2.3	117.0 ± 3.0	0.2219	108.6 ± 4.0	113.6 ± 4.3	0.1732
Leukocytes, 109/l	11.6 ± 0.6	9.1 ± 1.4	0.2101	12.1 ± 1.3	12.3 ± 1.6	1.0
Lymphocytes, %	69.0 ± 2.2	72.0 ± 3.8	0.9166	69.0 ± 5.4	63.8 ± 2.2	0.1732
Monocytes, %	2.8 ± 0.6	2.4 ± 0.6	0.6644	1.4 ± 0.6	4.0 ± 0.5	0.2289
Band neutrophils, %	1.8 ± 0.5	0.8 ± 0.4	0.1544	1.4 ± 0.2	0.8 ± 0.6	0.2282
Segmented neutrophils, %	26.0 ± 2.2	24.6 ± 3.7	0.9163	27.4 ± 4.9	28.0 ± 2.4	0.5309
ESR, mm/h	0.5 ± 0.0	0.5 ± 0.0	0.8808	0.4 ± 0.0	0.4 ± 0.0	0.4189
Thrombocytes, 109/l	211.0 ± 10.8	188.0 ± 10.3	0.2073	179.2 ± 8.4	210.4 ± 18.4	0.1161
Eosinophils, %	0.4 ± 0.2	0.2 ± 0.2	0.6005	0.8 ± 0.5	0.4 ± 0.2	0.722
Erythrocytes, 1012/l	8.4 ± 0.9	6.6 ± 0.2	0.1437	7.0 ± 0.8	6.6 ± 0.1	0.8345

Source: completed by L.I. Sabirzyanova.

Введение в ежедневный рацион животных кормовой добавки Protigen в дозе 500 мг/кг массы тела на протяжении 90 дней, также, как и в первой группе, привело к увеличению абсолютного числа лейкоцитов в 1,31 раз и процентного содержания палочкоядерных нейтрофилов в 2,25 раз относительно показателей контрольной группы (табл. 2). Через 10 дней после прекращения применения кормовой добавки во второй опытной группе значение определяемых показателей максимально приблизилось к значению показателей крови крыс контрольной группы, которые не получали кормовую добавку.

Таблица 2
Влияние применения кормовой добавки Protigen на гематологические показатели крыс опытной группы 2 и контрольной группы на 91‑й и 101‑й день эксперимента

Показатель	День 91‑й			День 101‑й
	Группа 2 (n = 10)	Контрольная группа (n = 5)	P	Группа 2 (n = 10)	Контрольная группа (n = 5)	P
	M ± SEM	M ± SEM		M ± SEM	M ± SEM
Гематокрит л/л	55.2 ± 1.6	53.0 ± 1.2	0.2477	52.8 ± 0.6	54.8 ± 1.0	0.0867
Гемоглобин, г/л	111.4 ± 3.7	117.0 ± 3.0	0.2492	118.6 ± 1.0	113.6 ± 4.3	0.2918
Лейкоциты, 109/л	11.9 ± 0.8	9.1 ± 1.4	0.2101	11.5 ± 1.6	12.3 ± 1.6	0.402
Лимфоциты, %	64.2 ± 3.5	72.0 ± 3.8	0.1732	66.2 ± 8.3	63.8 ± 2.2	0.2101
Моноциты, %	3.4 ± 1.2	2.4 ± 0.6	0.8271	3.8 ± 1.2	4.0 ± 0.5	0.6623
Нейтрофилы палочкоядерные, %	1.8 ± 0.4	0.8 ± 0.4	0.1251	1.2 ± 0.6	0.8 ± 0.6	0.6536
Нейтрофилы сегментоядерные, %	30.4 ± 2.6	24.6 ± 3.7	0.2463	28.6 ± 6.8	28.0 ± 2.4	0.4633
СОЭ, мм/ч	0.4 ± 0.0	0.5 ± 0.0	0.6005	0.4 ± 0.0	0.4 ± 0.0	0.6312
Тромбоциты, 109/л	226.4 ± 10.3	188.0 ± 10.3	0.0749	182.0 ± 15.2	210.4 ± 18.4	0.2477
Эозинофилы, %	0.2 ± 0.2	0.2 ± 0.2	0.8808	52.8 ± 0.6	54.8 ± 1.0	0.0867
Эритроциты, 1012/л	6.5 ± 0.2	6.6 ± 0.2	0.8335	118.6 ± 1.0	113.6 ± 4.3	0.2918

Источник: выполнила Л.И. Сабирзянова.

Table 2
Effect of Protigen feed additive on hematological parameters of rats in experimental group 2 and control group on 91^st and 101^st day of the experiment

Indicator	91 days			101 days
	Group 1 (n = 10)	Control group (n = 5)	P	Group 1 (n = 10)	Control group (n = 5)	P
	M ± SEM	M ± SEM		M ± SEM	M ± SEM
Hematocrit, l/l	55.2 ± 1.6	53.0 ± 1.2	0.2477	52.8 ± 0.6	54.8 ± 1.0	0.0867
Hemoglobin, g/l	111.4 ± 3.7	117.0 ± 3.0	0.2492	118.6 ± 1.0	113.6 ± 4.3	0.2918
Leukocytes, 109/l	11.9 ± 0.8	9.1 ± 1.4	0.2101	11.5 ± 1.6	12.3 ± 1.6	0.402
Lymphocytes, %	64.2 ± 3.5	72.0 ± 3.8	0.1732	66.2 ± 8.3	63.8 ± 2.2	0.2101
Monocytes, %	3.4 ± 1.2	2.4 ± 0.6	0.8271	3.8 ± 1.2	4.0 ± 0.5	0.6623
Band neutrophils, %	1.8 ± 0.4	0.8 ± 0.4	0.1251	1.2 ± 0.6	0.8 ± 0.6	0.6536
Segmented neutrophils, %	30.4 ± 2.6	24.6 ± 3.7	0.2463	28.6 ± 6.8	28.0 ± 2.4	0.4633
ESR, mm/h	0.4 ± 0.0	0.5 ± 0.0	0.6005	0.4 ± 0.0	0.4 ± 0.0	0.6312
Thrombocytes, 109/l	226.4 ± 10.3	188.0 ± 10.3	0.0749	182.0 ± 15.2	210.4 ± 18.4	0.2477
Eosinophils, %	0.2 ± 0.2	0.2 ± 0.2	0.8808	52.8 ± 0.6	54.8 ± 1.0	0.0867
Erythrocytes, 1012/l	6.5 ± 0.2	6.6 ± 0.2	0.8335	118.6 ± 1.0	113.6 ± 4.3	0.2918

Source: completed by L.I. Sabirzyanova.

Увеличение массы циркулирующих в крови эритроцитов и лейкоцитов, в т. ч. палочкоядерных нейтрофилов, может быть следствием усиления процесса образования этих клеток и выхода их в кровоток. Учитывая нахождение исследуемых показателей крови в пределах физиологической нормы, можно предположить, что наблюдаемые изменения приведут к улучшению метаболических процессов в организме при продолжении применения кормовой добавки.

При ежедневном клиническом осмотре животных общее состояние, особенности поведения, интенсивность и характер двигательной активности были в пределах физиологической нормы. Шерстный покров был чистым и блестящим. Видимые слизистые оболочки розового цвета, зрачок не расширен, положение хвоста естественное, количество и консистенция фекальных масс, частота мочеиспускания и окраска мочи в пределах референсных значений. Животные всех опытных групп охотно потребляли корм и воду. Отсутствовали возбуждение и угнетение, мышечные подергивания, тремор, парезы, выделения из носа, глаз, ротовой полости или иные признаки интоксикации.

Заключение

При изучении кормовой добавки Protigen в условиях эксперимента продолжительностью 101 день негативного влияния на гематологические показатели лабораторных животных не выявлено. Однако при более длительном применении и/или увеличении дозировки возможна ответная реакция организма со стороны системы крови в виде изменения гематологических показателей, в т. ч. выхода значений за пределы физиологической нормы.

Таким образом, для более корректной оценки биологических эффектов, в частности, влияния на гематологические показатели лабораторных животных, введения в их рацион кормовой добавки Protigen следует продолжить доклинические испытания в условиях хронического эксперимента и при повышении дозы с расширением изучаемых показателей для того, чтобы убедиться, что данная кормовая добавка является нетоксичной.

 

^{1 ГОСТ 33216—2014. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными.}

^{2 ГОСТ 34566—2019. Комбикорм для лабораторных животных. Общие технические условия.}

^{3 Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических лекарственных средств. 2‑изд., перераб. и доп. М. : Медицина, 2005. 832 с.}

Об авторах

Лилия Ильгизовна Сабирзянова

Санкт-Петербургский государственный университет ветеринарной медицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: l-sabirzyanova@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-6516-8857
SPIN-код: 3019-3782

кандидат ветеринарных наук

Российская Федерация, 196084, г. Санкт-Петербург, ул. Черниговская, д. 5

Список литературы