Indication and identification of infectious agents in animal products based on biochip technology with a biotin label and colorimetric detection

Cover Page

Abstract


The results of the development of DNA chips with biotin uterus and colorimetric detection to indicate and identify pathogens in animal products. The constant need to monitor for dangerous infectious diseases makes the urgency of developing new effective methods of identification of pathogens of these diseases. The high specificity and sensitivity of the technique, is 103-104 bacterial cells. The analysis takes 5-7 hours. Visual assessment of the end result allows for biochip test systems in stationary and field conditions, laboratories and regional reference centers. The application of modern biochip technology research quickly and with high reliability to detect infectious agents in a variety of biological materials, typified by strains in order to establish a common source of infection.

Введение. Для оценки микробиологической безопасности продукции животного происхождения как в России, так и за рубежом хорошо зарекомендовали себя методы ДНК- и иммунодиагностики. Среди них в последнее время все больше находит применение ДНК- и иммунобиочиповая технология [1-8]. Иммуномикрочиповая технология предназначена для одновременной качественной количественной оценки нескольких образцов продукции. В основе лежит технология микрочипа, базирующаяся на реакции антиген-антитело. Существует несколько модификаций этой технологии с использованием различных меток. Например, технология Evidence investigator фирмы «Randox», Великобритания, заключается в следующем: на микрочипе иммобилизованы моноклональные антитела, специфичные к различным агентам (токсинам, гормонам, антимикробным веществам, возбудителям заболеваний и т.д.). На чипе проходит сэднвич-иммуноанализ. Световой сигнал, генерируемый каждой из тестовых зон микрочипа, определяется при помощи технологий получения цифрового изображения. Рис. 1. Матрица распределения светового сигнала микрочипа Количественная оценка осуществляется с помощью калибровочной кривой, которую строят по стандартам образца с известной концентрацией. Регистрация конечного результата осуществляется с помощью хемилюминометра. Время реакции составляет от 10 до 20 минут. Весь анализ с пробоподготовкой занимает 1-2 часа. В нашей стране в ФГУП «ГосНИИ биологического приборостроения» ФМБА России разработана иммуномикрочиповая технология. Прибор-индикатор фосфоресценции импульсный ИФИ-03 регистрирует сигнал фосфоресценции с поверхности дна лунок микропланшетов (с чипов, выполненных в формате 96 луночных микропланшетов). Прибор также регистрирует длительную люминесценцию (технология ДЕЛФИЯ) и обычную флуоресценцию из объема жидкости в лунках микропланшета. Иммуночипы предназначены для выявления возбудителей чумы, сибирской язвы, туляремии, бруцелелза, легионеллеза, сапа и мелиоидоза и т.д. В Германии разработан метод ПЦР-ELISA для определения возбудителя сибирской язвы в твердых образцах. Используют микротитровальные планшеты, покрытые стрептавидином, и планшеты с ковалентносвязанными олигонуклеотидами. Чувствительность теста - 10fg (фг) чистой геномной ДНК или 10 спор, высеянных на 100 г твердого материала. Методику можно представить как вариант ДНК-иммуночипового анализа [7]. Биологические микрочипы - совершенно новое направление современной аналитической биологии и медицины. В 1999 г. на основании данных о различиях в структуре 16S и 23S рибосомальной РНК разработан микрочип, способный улавливать отличия в одну пару оснований в 16S рРНК и дифференцировать как виды, так и штаммы группы В. cereus. При этом только 2 из 40 штаммов других представителей группы имели последовательности 16S рРНК, идентичные В. antrhracis, но их можно было отличить от сибиреязвенного микроба на основании анализа последовательностей 23S рРНК [4]. В современных условиях при чрезвычайных ситуациях микрочиповая технология имеет перспективу применения в виде портативных устройств для быстрого обнаружения микроорганизма и мониторинга внешней среды. Предложен способ индикации, состоящий в использовании миниатюрного ультразвукового дезинтегратора со специальным картриджем для лизиса, разрушающего споры в течение 30 секунд, с последующим быстрым анализом в реальном времени на ПЦР-микрочипе. Для извлечения ДНК из спор используют минисоникатор. Общее время извлечения и анализа ДНК, используя минисоникатор и микрочип для ПЦР, составляет 15 мин [6]. В России разработан МАГИК-чип (матрица гель-иммобилизованных компонентов на микрочипе), который состоит из массива гидрофильных ячеек гидрогеля, закрепленных на гидрофобной поверхности стекла. Основные манипуляции, необходимые для анализа нуклеиновых последовательностей (ПЦР, отделение праймеров и продуктов амплификации от субстрата, гибридизация, лигирование и т.д.), могут быть проведены в ячейках чипа. В МАГИК-чипе для обнаружения В. anthracis ячейки чипа содержат иммобилизованные праймеры с генами lef и pag [8]. В США также разработан метод микрочиповой твердофазной экстракции для очистки ДНК из биологических образцов, таких как кровь. Кремниевые бусы упаковывают в стеклянные микрочипы и иммобилизуют бусы золь-гелем для стабилизации твердой фазы, на которой будет адсорбироваться ДНК. Оптимальное извлечение ДНК происходит при рН 6,1-7,6. Такие низкие значения рН позволяют сократить время экстракции с 25 мин до 15 мин. При этом единственная стадия приготовления ДНК из крови для анализа на микрочипе - смешивание крови с буфером для нанесения. Процедура детекции инфекционного агента занимает менее 30 мин [8]. Цель исследований. В своей работе мы попытались разработать ДНК-чипы с биотиновой меткой и колориметрическим детектированием. Исследуемые пробы крови или животной ткани искусственно контаминировали бактериями в концентрациях 105-106 м.к./мл. Затем из них выделяли ДНК. Бактерии лизировали в Трис-ЭДТА буфере, содержащем лизоцим и протеиназу К. Дальнейшую очистку ДНК проводили с помощью детергента «Silico» и магнитосепарации. ДНК осаждали двойным объемом этанола. Проводили однократную промывку 80-процентным этанолом для осветления раствора ДНК. Выделенную и очищенную ДНК растворяли в стандартно-солевом растворе (ССР), денатурировали в кипящей водяной бане в течение 5-10 мин, иммобилизовали на мембранные биочипы, предварительно обработанные раствором 10´ССР в виде точек, не допуская их перекрывания. Иммобилизованную ДНК гибридизовали с меченными ДНК-зондами. В качестве ДНК-зондов использовали олигонуклеотидные ДНК последовательности, полученные с помощью ПЦР реакции с коммерческими праймерами на B. subtilis или B. аnthracis, например, олигонуклеотидные праймеры, комплементарные последовательностям хромосомных генов fliC и hom2, имеющие следующие последовательности: fliC-F: 5'-TGGAGCAGTAACAATTGG-3', fliC-R: 5'-GCACCACTGATAGAAATGTTAG-3', hom2-F: 5'-GACGTGTTAAAAGAAGCCCA-3', hom2-R: 5'-CACCAATTTCGTCTTTTACA-3'. На следующем этапе чип обрабатывали конъюгатом стрептавидина с щелочной фосфатазой. На заключительном этапе вносили субстратный раствор. Окрашивание соответствующих точек свидетельствовало о наличии искомой бактериальной ДНК в исследуемом материале. На чип наносили 3 мл гибридизационного раствора. Инкубировали чип 4 часа при 65 °С в плотно закрытой чашке Петри. Чип отмывали трехкратно по 5 мин на качалке при комнатной температуре в 30 мл отмывочного раствора № 1. Затем отмывали двукратно по 5 мин при температуре 65 °С в 40 мл отмывочного раствора № 2. Затем отмывали однократно в течение 5 мин на качалке при комнатной температуре в 20 мл отмывочного раствора № 3. Чип помещали в 25 мл блокирующего раствора и инкубировали 20 мин при 37 °С. Для проведения реакции связывания конъюгата чип ополаскивали в 20 мл раствора TST и переносили в чашку Петри с парафильмом на дне. Наслаивали на чип сверху 3 мл раствора конъюгата и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Чип отмывали трехкратно по 10 мин на качалке при комнатной температуре в 30 мл раствора TST и однократно в 7 мл раствора проявляющей смеси. Переносили чип в чашку Петри с настеленным на дно парафильмом и наслаивали сверху 3 мл проявляющей смеси. Чип инкубировали в темноте при 37 °С или при комнатной температуре в течение нескольких 2-3 часов до появления окраски в пятне, содержащем контрольный положительный образец. Чип промывали в водопроводной воде для остановки проявления и высушивали, проводили оценку результата. На рисунке 2 схематично представлены результаты окрашивания точек чипов с гибридными молекулами ДНК. 1 2 3 Рис. 2. Схематичные результаты окрашивания точек чипов 1 - отрицательный контроль (фон - чистый чип, без ДНК); 2 - отрицательный контроль (иммобилизованная ДНК B. subtilis + ДНК-зонд на B. anthracis); 3 - положительный контроль (иммобилизованная ДНК на B. anthracis + ДНК-зонд на B. anthracis) В таблице 1 представлены результаты гибридизации ДНК-зондов с иммобилизованными на биочипах ДНК различных бактерий, которые показывают высокую специфичность методики. Как видно из представленных данных, гибридизация происходит только в гомологичных системах (иммобилизованная ДНК и ДНК-зонд одного и того же вида бактерий). Чувствительность метода составляла 103-104 бактериальных клеток. Таблица 1 Специфичность методики определения возбудителей инфекций на основе биочиповой технологии с биотиновой меткой и колориметрическим детектированием Иммобилизованная на чипе ДНК ДНК-зонд на B. anthracis ДНК-зонд на B. subtilis Степень окрашивания чипов Степень окрашивания чипов B. anthracis ++++ - B. subtilis - ++++ B. cereus - - E. coli - - Еrуsipelothrix insidiosa (возбудитель рожи свиней) - - Примечания: (++++) - максимальное окрашивание; (-) - отсутствие окрашивания или на уровне фона. Заключение. Разработанная методика дает возможность проводить индикацию и идентификацию возбудителей инфекций, включая особо опасные в продукции животного происхождения. Анализ занимает 5-7 часов. Визуальная оценка конечного результата позволяет применять биочиповые тест-системы в стационарных и полевых условиях. Использование современных молекулярно-биологических методов и, в частности, биочиповой технологии исследования позволяет не только быстро и достоверно обнаруживать возбудителей инфекций в различных биологических материалах, но и типировать штаммы с целью установления общего источника инфекции. © Локорев А.В., Нитяга И.М., Федюшин Д.В., Хоменец Н.Г., Шаманова Л.А., 2016 REFERENCES [1] Babunova V.S., Onishhenko D.A., Jarova O.A., Artemov A.V., Kondrat'eva M.V., Lucyk S.V. Primenenie immunomikrochipovoj tehnologii dlja kontrolja bezopasnosti i kachestva pishhevyh produktov. Sbornik GNU VNIIVSGJe «Problemy veterinarnoj sanitarii, gigieny i jekologii». M., 2011. № 1(5). S. 12-17. [2] Barskij V.E., Kolchinskij A.M., Lysov Ju.P, Mirzabekov A.D. Biologicheskie mikrochipy, soderzhashhie immobilizovannye v gidrogele nukleinovye kisloty, belki i drugie soedinenija: svojstva i prilozhenie v genomike. Mol. biol. 2002. T. 36. № 4. S. 563-584. [3] Kutyrev V.V., Smirnova N.I.. Genodiagnostika i molekuljarnoe tipirovanie vozbuditelej chumy, holery i sibirskoj jazvy. Mol. gen. mikrobiol. virusol. 2003. № 1. S. 6-14. [4] Svetlichkin V.V., Kononenko A.B., Jarkov S.P., Strelkov A.A., Kondrat'eva M.V., Panjushkin A.I. Test-sistemy i tehnicheskie sredstva uskorennogo kontrolja bezopasnosti i kachestva ob’ektov veterinarnogo nadzora. Sbornik GNU VNIIVSGJe «Problemy veterinarnoj sanitarii, gigieny i jekologii». M., 2010. № 1. S. 26-33. [5] Nitjaga I.M., Usha B.V., Morozova E.N., Homenec N.G. Usovershenstvovanie kontrolja sal'monell v mjase i mjasnyh produktah s pomoshh'ju PCR v rezhime real'nogo vremeni i robototehniki dlja vydelenija matrichnoj DNK. Vestnik Rossijskogo universiteta druzhby narodov. Serija: Agronomija i zhivotnovodstvo. 2016. № 1. S. 61-65. [6] Belgrader P., Hansford D., Kovacs G.T., Venkateswaran K., Mariella R.Jr., Milanovich F., Nasarabadi S., Okuzumi M., Pourahmadi F., Northrup M.A. A minisonicator to rapidly disrupt bacterial spores for DNA analysis. Anal. Chem. 1999. V. 71. N. 19. P. 4232-6. [7] Beyer W., Pocivalsek S., Bohm R. Polymerase chain reaction-ELISA to detect Bacillus anthracis from soil amples-limitations of present published primers. J. Appl. Microbiol. 1999. V. 87. N. 2. P. 229-36. [8] Breadmore M.C., Wolfe K.A., Arcibal I.G., Leung W.K., Dickson D., Giordano B.C., Power M.E., Ferrance J.P., Feldman S.H., Norris P.M., Landers J.P. Microchip-based purification of DNA from biological samples. Anal. Chem. 2003. V. 75. N. 8. P. 1880-6. [9] Porte J., oLoan N., Bell B., Mahoney J., McGarrity M., McConnell Rl., Fitzgerald SP. Development of an Evidence biochip array kit for the multiplex screening of more than 20 anthelmintic drugs. Anal. Bioanal Chem. 2012 Jul. 403(10). R.3051-6.

A V Lokorev

FGBNU “All-Russian Research and TechnologyInstitute of Biological Industry”

Author for correspondence.
Email: svetl.bbc@yandex.ru
p. Biokombinat, n. Kashintseva, Shchelkovo district, Moscow region, Russia, 141142

I M Nityaga

FGBOU VPO “Moscow State University of Food Production”

Email: inga99@mail.ru
Volokolamsk highway, 11, Moscow, Russia, 125080

D V Fedyushin

FGBOU VPO “Moscow State University of Food Production”

Email: svetl.bbc@yandex.ru
Volokolamsk highway, 11, Moscow, Russia, 125080

N G Khomenets

3Peoples’ Friendship University of Russia

Email: biology@mail.ru
Miklykho-Maklaya str., 8/2, Moscow, Russia, 117198

L A Shamanova

FGBNU “All-Russian Research and TechnologyInstitute of Biological Industry”

Email: svetl.bbc@yandex.ru
p. Biokombinat, n. Kashintseva, Shchelkovo district, Moscow region, Russia, 141142

Views

Abstract - 128

PDF (Russian) - 45

PlumX


Copyright (c) 2016 Локорев А.В., Нитяга И.М., Федюшин Д.В., Хоменец Н.Г., Шаманова Л.А.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.