Идентификация Pseudomonas fuscovaginae, Pseudomonas syringae и Xanthomonas translucens в зерне пшеницы методом ПЦР

Введение

В 2019—2020 гг. Россия экспортировала зерно по кодам ТН ВЭД 1001 (пшеница и меслин), 1002 (рожь), 1003 (ячмень), 1004 (овес) на сумму около 9,5 млрд долларов, что сделало ее крупнейшим экспортером пшеницы в мире [1]. Основными импортерами зерна из России были Саудовская Аравия, Египет, Турция, Бангладеш, Иран, Нигерия, Китай и Пакистан, из которых Турция импортировала 9, а Саудовская Аравия 3,2 млн тонн в 2020 г. [1]. Фитосанитарными требованиями указанных стран регулируются один или несколько возбудителей бактериозов зерновых культур, принадлежащих следующим видам: Pseudomonas fuscovaginae, Pseudomonas syringae и Xanthomonas translucens [2, 3].

Основным источником распространения бактериозов зерновых культур являются зараженные семена [4], при этом симптомы заболевания в случае его наличия не позволяют идентифицировать возбудителя. Для осуществления фитосанитарного контроля бактериозов пробы от партий зерна подлежат лабораторной диагностике.

Известные в настоящее время методы диагностики P. fuscovaginae предполагают использование комбинации из 2 и более тестов, среди которых: выделение культуры бактерии на селективных и полуселективных средах, тест на патогенность, биохимические тесты, серотипирование, а также анализ профилей жирных кислот, исследование содержания общего белка в клетках, иммунодиагностика, иммунофлуоресценция и молекулярно-генетические тесты [5]. Для идентификации P. syringae отмечено несколько диагностических тестов, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР) [6]. Методы идентификации X. translucens основаны на структуре колоний, цвете, биохимическом анализе, патогенности и ПЦР [7].

Среди вышеперечисленных методов диагностики ПЦР является наиболее применимым в практике фитосанитарных лабораторий в связи с универсальностью и быстротой выполнения. Только использование тестов на основе ПЦР в сочетании с быстрым методом подготовки проб позволяет провести диагностику в течение суток. В то же время не описаны критерии использования ПЦР при диагностике P. fuscovaginae, P. syringae и X. translucens в тотальной ДНК, выделенной из семян. Тестирование ДНК из образца семян требует оптимального метода подготовки проб, проведенного в кратчайшие сроки. На сегодняшний день существует только описание метода замачивания семян в течение 24 часов [8]. Однако P. syringae может находиться внутри семян, как было показано при исследовании зараженных семян гороха [9].

В связи с тем, что целевые бактерии могут находиться как на поверхности семян, так и внутри [10], методы промывки и экстракции менее эффективны, чем измельчение семян [8]. В то же время измельчение приводит к попаданию в образец большого количества крахмала, одного из ингибиторов ПЦР [11].

Совершенствование процесса лабораторной диагностики значимых для экспорта зерна видов бактерий —  P. fuscovaginae, P. syringae и X. translucens —требует оптимизации метода подготовки проб, позволяющего сразу проводить ПЦР-тестирование.

Цель исследования — оптимизация процесса подготовки проб семян для последующего выявления и идентификации Pseudomonas fuscovaginae, Pseudomonas syringae и Xanthomonas translucens методом ПЦР.

Материалы и методы исследования

Объектами исследования являлись пробы зерна пшеницы, зараженные суспензиями бактерий P. fuscovaginae, P. syringae pv. coronafaciens и X. translucens в определенных концентрациях. Исследование проводили в марте 2022 г.

Воздушно-сухое зерно пшеницы ссыпали в общую емкость и перемешивали для придания однородности пробам. С помощью электронных весов (AJH-4200CE, Vibra, Япония) взвешивали лабораторные пробы, масса каждой из которых составляла 25±0,2 г. Лабораторные пробы помещали в пакеты для гомогенизации и добавляли 54 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) (PM 7/24 (4), EPPO, 2019). Пакеты с пробами в специальном штативе помещали на орбитальный шейкер (Unimax 2010, Heidolph, Германия) и устанавливали режим 2 ч, 100 об/мин. После запуска шейкера приступали к приготовлению бактериальных суспензий.

Для приготовления суспензий использовали 3-суточные чистые живые культуры P. fuscovaginae (штамм 0335 в коллекции ВНИИКР), P. syringae pv. coronafaciens (штамм 0440 в коллекции ВНИИКР) и 7-суточную чистую живую культуру X. translucens (штамм 0337 в коллекции ВНИИКР). Для штаммов 0440 и 0335 в исследовании использовали среду Кинга Б (PM 7/43 (1), EPPO, 2004), а для штамма 0337 —  среду LB [12]. Суспензии бактерий готовили в микропробирках объемом 1,5 мл, используя стерильный PBS. Начальная суспензия бактерий по мутности визуально почти не отличалась от чистого PBS.

Концентрацию бактерий в суспензии определяли методом Коха [13], высевая с помощью шпателя Дригальского по 100 мкл 6, 7 и 8 разведений на 3 чашки Петри с соответствующей средой и проводя подсчет колоний спустя 7 суток выдерживания чашек при +25 °C в инкубаторе (MIR-254, Panasonic Healthcare Co. Ltd., Япония). Приготовленные бактериальные суспензии сразу использовали для заражения лабораторных проб семян пшеницы.

В пакет с пробой добавляли 6 мл одного из разведений начальной суспензии — 2 , 3, 4 или 5. Одну пробу семян оставили не зараженной в качестве отрицательного контрольного образца. По истечении 2 ч встряхивания проб на шейкере проводили их обработку с помощью лабораторных гомогенизаторов (Bag Mixer 400SW, Interscience, Франция) при режиме 5 мин, скорость 4, ближнее к дверце гомогенизатора положение лопаток. После гомогенизации пробы встряхивали на шейкере в течение 15 мин. При режиме 100 об/мин, а после жидкую часть проб переливали в центрифужные пробирки объемом 50 мл и центрифугировали при режиме 5 мин, 1200 g, 4 °C (Allegra X-30R, Beckman Coulter, Дания). Затем надосадочную жидкость переносили в чистые центрифужные пробирки и центрифугировали при режиме 10 мин, 10000g, 4 °C. Надосадочную жидкость удаляли, а к осадку добавляли 1 мл PBS, встряхивали на вортексе и переносили полученную аналитическую пробу в микропробирку.

Выделение ДНК проводили сорбционным методом («Проба-ГС», АгроДиагностика, Россия), используя 200 мкл каждой аналитической пробы в двухкратной повторности, а также 200 мкл 3, 4, 5 и 6 разведений бактериальных суспензий в PBS. Диагностику бактерий в выделенной ДНК проводили с использованием видоспецифичных праймерных систем.

Для диагностики P. fuscovaginae в образцах ДНК использовали набор Pseudomonas fuscovaginae-РВ, Синтол, Россия. Чтобы оценить наличие ингибирования ПЦР, указанным набором тестировали бактериальные суспензии штаммов 0440 и 0337 и зараженные данными штаммами экстракты. ПЦР проводили в соответствии с инструкцией производителя на детектирующем амплификаторе (ДТпрайм 5М6, ДНК-Технология, Россия).

Диагностику P. syringae pv. coronafaciens проводили с использованием праймеров PsyF/PsyR (длина ампликона 144 п. о.) [14]. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала праймеры в конечной концентрации 0,16 микромоль, мастер-микс 5x ScreenMix-HS (Евроген, Россия) и 2 мкл ДНК. Тестирование на наличие ДНК X. translucens проводили с помощью праймеров 4F1/4R 1 (длина ампликона 500 п. о.); состав реакционной смеси соответствовал составу, изложенному в источнике [15]. Программа амплификации для ПЦР с праймерами PsyF/PsyR и 4F1/4R 1: 5 мин при 95 °C, 40 циклов: 30 с при 95 °C, 30 с при 61 °C и 30 с при 72 °C; 7 мин при 72 °C (T100 Thermal Cycler, BioRad, США). Продукты ПЦР разгоняли в 1,5 % агарозном геле при режиме В —  130, мА —  165, Вт —  40, 50 мин (Эльф-4, ДНК-Технология, Россия). Результат ПЦР интерпретировали по электрофореграммам, снятым на гельдокументирующей системе (BioRad, США).

Результат тестирования образца считали положительным, если присутствовала специфическая реакция для гена-мишени ПЦР в виде экспоненциальной кривой при использовании ПЦР в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ) или ампликона определенного размера при использовании классической ПЦР, отсутствовала специфическая реакция для отрицательного контроля и отмечалась реакция внутреннего положительного контроля (ВПК) для отрицательного контрольного образца (ОКО) — отсутствие ингибирования ПЦР. Результат тестирования образца считали отрицательным, если отсутствовала специфическая реакция ПЦР, отмечалась реакция ВПК и присутствовала специфическая реакция для положительного контрольного образца (ПКО). В остальных случаях результат ПЦР считали недостоверным.

Результаты исследования и обсуждение

Обработка с помощью гомогенизатора при режиме 5 мин, скорость 4 пробы семян, выдержанной в PBS в течение 2 ч, привела к раздроблению каждого зерна в пробе и образованию муки крупного помола.

Полученный результат свидетельствует о том, что двухчасового замачивания семян и их обработки гомогенизатором при указанном режиме достаточно, чтобы эффективно разрушить каждое зерно в пробе и обеспечить тем самым выход бактерий в жидкую часть пробы. Используемый солевой буфер при этом является экстрагентом, позволяющим извлечь бактерии из оставшихся целыми частиц зерен в последующие 15 мин встряхивания на шейкере.

Первое низкооборотное центрифугирование при режиме 5 мин, 1200 g, 4 °C привело к образованию мучного осадка массой 1±0,3 г в каждом образце. Использование этапа низкооборотного центрифугирования позволило избавиться от большей части содержащегося в пробе крахмалa, одного из возможных ингибиторов последующих ПЦР-тестов [11]. Центрифугирование надосадочной жидкости при режиме 10 мин, 10000g, 4 °C позволил получить концентрированную микробиоту, содержащуюся в пробе зерна, количество муки в полученном концентрате при этом было минимальным.

После выделения ДНК из полученных аналитических проб и ПЦР-тестирования оценивали эффективность используемого метода подготовки проб, опираясь на результат определения числа колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) в тестируемых бактериальных суспензиях (табл. 1).

Таблица 1. Результат определения числа колониеобразующих единиц, КОЕ/мл, в тестируемых бактериальных суспензиях спустя 7 суток после посева

Table 1. The number of colony-forming units (CFU/ml) in the tested bacterial suspensions 7 days after plating

Бактериальные суспензии 2-го, 3-го, 4-го и 5-го разведения использовали для инокуляции образцов семян PBS в соотношении 1:9, концентрации бактерий в контаминированных экстрактах семян перед центрифугированием соответствовали приведенным в табл. 1.

ПЦР-тестирование образцов, содержащих штамм 0335, показало присутствие P. fuscovaginae как в бактериальных суспензиях в PBS, так и в инфицированных образцах зерна пшеницы (табл. 2).

Таблица 2. Результат тестирования образцов выделенной ДНК набором Pseudomonas fuscovaginae-РВ (Синтол, Россия)

Примечание. Ct — пороговый цикл ПЦР; FAM — канал детекции специфики ПЦР; HEX — канал детекции внутреннего положительного контроля ПЦР; + — положительно; — — отрицательно; PBS — фосфатно-солевой буфер; ПКО — положительный контрольный образец; ОКО — отрицательный контрольный образец

Table 2. The result of DNA-testing by ‘Pseudomonas fuscovaginae-RT’ kit (Sintol, Russia)

Note: Ct — PCR threshold cycle; FAM — PCR specific detection channel; HEX — PCR internal positive control detection channel; «+» — positive; «–» — negative; PBS — phosphate-buffered saline; PCS — positive control sample; NCS — negative control sample.

Результат ПЦР-тестирования отрицательных контрольных образцов (незараженных проб зерна и PBS) был отрицательным. Недостоверные результаты отсутствовали.

В каждом из тестируемых образцов, зараженных штаммом 0440, бактерия Pseudomonas syringae была обнаружена (рис. 1).

Рис. 1. Электрофореграмма результата ПЦР-тестирования образцов, зараженных штаммом 0440, на наличие Pseudomonas syringae с праймерами PsyF/PsyR: 1, 10, 11 и 20 — маркер длины ДНК; 2, 3 — отрицательный контрольный образец (экстракт); 4 — отрицательный контрольный образец (буфер); 5—8 — буфер, зараженный штаммом 0440 в концентрациях 3,7·106—3,7·103 соответственно; 9, 12 — штамм 0440 в экстракте (3,7·106); 13, 14 — штамм 0440 в экстракте (3,7·105); 15, 16 — штамм 0440 в экстракте (3,7·104); 17,18 — штамм 0440 в экстракте (3,7·105); 19 — положительный контрольный образец
Fig. 1. Electropherogram of PCR testing of samples infected with strain 0440 for the presence of Pseudomonas syringae with PsyF/PsyR primers: 1, 10, 11 and 20—100 bp DNA length marker; 2, 3 — Negative control sample (Extract); 4 — pure Phosphate buffered saline (PBS); 5, 8 — PBS infected with strain 0440 at concentrations of 3.7×106—3.7×103 respectively; 9, 12 — strain 0440 in extract (3.7×106); 13, 14 — strain 0440 in extract (3.7×105); 15, 16 — strain 0440 in extract (3.7×104); 17,18 — strain 0440 in extract (3.7×105); 19 — Positive control sample

ПЦР с ДНК отрицательных контрольных образцов при тестировании с праймерами PsyF/PsyR показала отрицательный результат. Недостоверные результаты отсутствовали. Аналогичный результат тестирования отрицательных контрольных образцов был получен в ПЦР с праймерами 4F1/4R 1 (рис. 2).

Рис. 2. Электрофореграмма результата ПЦР-тестирования образцов, зараженных штаммом 0337, на наличие Xanthomonas translucens с праймерами 4F1/4R 1: 1, 10, 11 и 20 — маркер длины ДНК; 2, 3 — отрицательный контрольный образец (экстракт); 4 — отрицательный контрольный образец (буфер); 5—8 — буфер, зараженный штаммом 0337 в концентрациях 1,5·106—1,5·103 соответственно; 9, 12 — штамм 0337 в экстракте (1,5·106); 13, 14 — штамм 0337 в экстракте (1,5·105); 15, 16 — штамм 0337 в экстракте (1,5·104); 17, 18 — штамм 0337 в экстракте (1,5·105); 19 — положительный контрольный образец
Fig. 2. Electropherogram of PCR testing of samples infected with strain 0337 for the presence of Xanthomonas translucens with primers 4F1/4R 1: 1, 10, 11 and 20—100 bp DNA length marker; 2, 3 — Negative control sample (Extract); 4 — Pure Phosphate buffered saline (PBS); 5, 8 — PBS infected with strain 0337 at concentrations of 1.5×106—1.5×103 respectively; 9, 12 — strain 0337 in extract (1.5×106); 13, 14 — strain 0337 in extract (1.5×105); 15, 16 — strain 0337 in extract (1.5×104); 17, 18 — strain 0337 in extract (1.5×105); 19 — Positive control sample

Для образцов, зараженных штаммом 0337, были получены положительные результаты при тестировании с праймерами 4F1/4R 1.

Ингибирование ПЦР при использовании набора Pseudomonas fuscovaginae-РВ не наблюдалось ни для одного из протестированных образцов ДНК, выделенной из проб, зараженных штаммами 0335, 0337 и 0440. Данный результат показывает, что двойное центрифугирование при подготовке проб эффективно для удаления крахмала, оставшегося в пробе вследствие дробления семян. Нам известно об успешном использовании метода удаления ингибирующих веществ из растительного материала путем двухэтапного центрифугирования [15], но для удаления крахмала при подготовке проб зерна пшеницы к ПЦР-тестированию, по нашим сведениям, он ранее не использовался. Полученный результат также позволяет сделать вывод о том, что ДНК была эффективно выделена набором «Проба-ГС», АгроДиагностика (Россия).

Заключение

В результате исследования отмечено, что обработка с помощью гомогенизатора пробы семян, выдержанной в PBS в течение 2 ч, позволяет раздробить каждое зерно в пробе и обеспечить выход бактерий, если они присутствуют в семенах. Метод дробления очень эффективен при диагностике бактерий, передающихся семенами, так как обеспечивает исследование всей части семени, как в случае наличия бактерий на поверхности, так и внутри семян. Первое низкооборотное центрифугирование позволило эффективно осадить измельченное зерно и избавиться от большей части крахмала. Высокоскоростное центрифугирование надосадочной жидкости позволило получить концентрированную микробиоту, содержащуюся в образце зерна, с минимальным количеством муки. Использование набора для выделения ДНК «Проба-ГС», АгроДиагностика (Россия) позволило получить ДНК образцов достаточного для ПЦР-тестирования качества. С помощью набора Pseudomonas fuscovaginae-РВ, Синтол (Россия) была успешно обнаружена ДНК P. fuscovaginae в каждом из зараженных этой бактерией образцов в пределах чувствительности теста 10³ КОЕ/мл. Использование праймеров PsyF/PsyR и 4F1/4R 1 позволило обнаружить ДНК P. syringae и X. translucens соответственно в каждом из зараженных этими бактериями образце в концентрациях 10³ КОЕ/мл. Отмечено отсутствие ингибирования ПЦР при использовании изложенных методов подготовки проб и тестирования. Метод удаления крахмала из проб для молекулярной диагностики фитопатогенов, насколько нам известно, использовался впервые. Применение использованных в работе методов позволит проводить диагностику значимых для экспорта зерна возбудителей бактериозов в течение одного дня.