Молекулярно-биологический маркер BCL-2: анализ семенников при пренатальном введении эстрогенов белым лабораторным мышам

Полный текст

Введение

В ветеринарной медицине в качестве одного из современных методов диагностики заболеваний животных применяется иммуногистохимическое исследование. Метод используется как в лечебной практике, так и в научных разработках при дифференциальной диагностике заболеваний опухолевой и неопухолевой природы [1].

Центральное место в изучении регуляции процесса апоптоза занимают молекулярные белки семейства Bcl-2, которые отражают синтетические процессы, протекающие в клетках и тканях органов человека и животных. Белки Bcl-2 находятся в постоянном динамическом равновесии, являются фактором выживания клеток органов, защищая ее от программированной гибели. В научных источниках считается, что соотношение активных форм белков Bcl-2 определяет равновесие между жизнью и смертью клетки [2–4].

Определение белков семейства Bcl-2 в клетках и тканях органов выполняют ИГХ-методом, основанным на детекции уровня белка в клетке и позволяющем выявить экспрессию Вcl-2 [5].

Уменьшение концентрации Bcl-2 приводит к апоптотической гибели клеток, тогда как сверхэкспрессия его защищает клетки от смерти. В свою очередь в структурах ядер органов ген Bcl-2 выполняет функцию негативного регулятора апоптоза [6].

Пренатальное влияние эстрогенов на ранних стадиях антенального развития, в особенности периода закладки репродуктивных органов приводит к нарушению разнообразных морфологических изменений в органах, проявляющихся в постнатальной жизни у разных видов животных, особенно при проведении искусственного осеменения [7–9].

Создание модели с экспериментальными животными — важный аспект клинических исследований, так как от качества исследуемой модели зависит обоснованность фундаментальных выводов, механизмов развития заболеваний, результатов доклинических испытаний используемых медикаментозных препаратов [10, 11].

Пренатальное экспериментальное исследование влияния и изучения последствий применения препаратов с эстрогенной активностью является актуальной и малоизученной научной проблемой.

Цель исследования — иммуногистохимический анализ маркера Bcl-2 при пренатальном воздействии различных доз синтетического аналога эстрогена синэстрола на семенники потомства белых беспородных лабораторных мышей.

Материалы и методы исследования

Эксперимент выполнен на самках (n = 36) и самцах (n = 9) белых лабораторных мышей массой 19…21 г. Экспериментальные животные содержались в стандартных условиях при круглосуточном доступе к воде и пище. Все эксперименты, уход и содержание осуществлялись в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета европейского союза по охране животных, используемых в научных целях. После фертилизации беременных самок разделили на 3 группы — одна интактная и две экспериментальные группы. Принимая во внимание физиологическую экспрессию гормонов мышей каждой самке в отдельности на стадии гестации Е 11.5 беременности в одно и тоже время суток, однократно, внутримышечно вводили различные дозы исследуемых препаратов. Интактная группа — без воздействия (n = 10). Первой экспериментальной группе С-25 (n = 13) вводили эстрогеновый препарат синестрол в виде 2 % масляного раствора в дозе 25 мкг/кг. Второй экспериментальной группе C-40 (n = 13) вводили эстрогеновый препарат синестрол в виде 2 % масляного раствора в дозе 40 мкг/кг. Расчеты эффективности доз препаратов проводили в соответствии с коэффициентом для перерасчета доз веществ в мкг/кг для мышей1 [12, 13]. Введение лекарственных средств в эксперименте проводили по Методическим рекомендациям изучения общетоксичского действия фармакологических веществ2. По пять экспериментальных животных, рожденных от самок каждой группы, оставляли с матерью до одного месяца, после чего полученное потомство (n = 15) — отдельно самцов и самок — отсаживали в клетки. По достижению половозрелого возрастапотомство выводили из эксперимента в фазу диэструса. Определяли эстральный цикл, используя влагалищные мазки, окрашенные по критериям M.C. Cora [14].

Иммуногистохимический анализ проводили на семенниках потомства белых лабораторных мышей, фиксацию и гистологическую проводку осуществляли по стандартной схеме. Подсчет структур семенников потомства производили под иммерсионным объективом на стандартных полях зрения 903.

Иммуногистохимическим методом определяли маркер ингибитора апоптоза Bcl-2. Анализ проводили на срезах с парафиновых блоков семенников потомства, предназначенных для стандартного морфологического исследования. Парафиновые срезы депарафинировали и регидратировали по стандартной методике, используя непрямую стрептавидин-­биотиновую систему детекции Leica BOND (Novocastra™, Германия) для мыши (Mouse Monoclonal Antibody Bcl-2 Oncoprotein. Клон N-19, разведение: 1:300) по рекомендации производителя Santa Cruz Biotechnology (США). Гистологические срезы толщиной 4 мкм окрашивали с помощью иммуногистостейнера Leica Microsystems Bond™ (Германия). В 10 полях зрения при увеличении x100 проводилась оценка окрашенных препаратов каждого образца с использованием светового микроскопа Leica. Среднее число положительных к антигенам клеток вычисляли соотношением с клетками, в которых эти антигены не определялись (на 100 просчитанных клеток).

Экспрессию маркера Bcl-2 оценивали в семенниках потомства: сперматогониях, сперматоцитах, сперматидах, сперматозоидах, клетках Лейдига.

Статистическую обработку осуществляли с использованием программы Statistica 7.0 (StatSoft, США). По каждому параметру вычисляли среднее арифметическое значение и его стандартную ошибку (М ± SD). Достоверность изменений оценивали с помощью метода Краскела — Уолиса, различия определяли при достигнутом уровне значимости Р < 0,05.

Результаты исследования и обсуждение

Результаты экспрессии маркера Bcl-2 семенников потомства лабораторных мышей при пренатальном введении синтетического препарата синэстрол приведены в таблице и на рис. 1–3.

Количество Bcl-2 иммунопозитивных клеток в семенниках потомства белых беспородных лабораторных мышей при пренатальном введении синтетического препарата синэстрол

Показатели	Интактная	С-25	С-40
Клетки сперматогониев в эпителии извитого семенного канальца	25,4 ± 1,8	27,6 ± 1,7	27,8 ± 1,5
Клетки сперматоцитов в эпителии извитого семенного канальца	29,2 ± 1,3	29,6 ± 2,1	29,4 ± 1,1
Клетки сперматид в эпителии извитого семенного канальца	24,8 ± 0,8	25,8 ± 0,8	26,0 ± 1,1
Клетки сперматозоидов в просвете извитого семенного канальца	119,4 ± 0,5	117,8 ± 0,9	116,9 ± 1,9
Клетки Лейдига в соединительнотканной строме между извитыми семенными канальцами	5,0 ± 0,7	2,2 ± 0,8*	2,0 ± 0,7*

Примечание. * Р < 0,05 в сравнении с интактной группой.

Number of Bcl-2 immunopositive cells in testes of outbred laboratory mice offspring after prenatal injection of Sinestrol synthetic drug

Indicators	Control	С-25	С-40
Spermatogonian cells in epithelium of convoluted seminiferous tubule	25.4 ± 1.8	27.6 ± 1.7	27.8 ± 1.5
Spermatocyte cells in epithelium of convoluted seminiferous tubule	29.2 ± 1.3	29.6 ± 2.1	29.4 ± 1.1
Spermatid cells in epithelium of convoluted seminiferous tubule	24.8 ± 0.8	25.8 ± 0.8	26.0 ± 1.1
Sperm cells in lumen of convoluted seminiferous tubule	119.4 ± 0.5	117.8 ± 0.9	116.9 ± 1.9
Leydig cells in connective tissue stroma between convoluted seminiferous tubules	5.0 ± 0.7	2.2 ± 0.8*	2.0 ± 0.7*

Note: *Р < 0.05 in comparison with the control group.

Показатель экспрессии маркера Bcl-2 в группах С-25 и С-40 увеличился в клетках сперматогониев в эпителии извитого семенного канальца на 8,6 и 9,4 % по сравнению с интактной группой, что согласуется с результатами зарубежных авторов [3, 5, 15]. В экспериментальных группах С-25 и С-40 в клетках сперматоцитов в эпителии извитого семенного канальца уровень экспрессии значимых различий не выявил. В клетках сперматидов в обеих экспериментальных группах произошло незначительно увеличение количества позитивно окрашенных клеток экспрессии маркера Bcl-2. В экспериментальных группах С-25 и С-40 в клетках сперматидов значимых различий в показателях экспрессии маркера Bcl-2 не было выявлено. Сравнительный анализ с интактной группой показал, что в экспериментальных группах С-25 и С-40 произошло статистически значимое уменьшение степени экспрессии маркера Bcl-2 количества позитивно окрашенных клеток Лейдига в слоях соединительной ткани между извитыми семенными канальцами на 56,0 (Р < 0,05) и 60,0 % (Р < 0,05) соответственно.

Рис. 1. Семенник потомства интактной группы. ИГХ-реакция на маркер Bcl‑2. Докраска ядер гематоксилином. ×100
Источник: выполнено авторами
Fig. 1. Testis of the intact group offspring. IHC reaction to Bcl-2 marker. Nucleus staining with hematoxylin. ×100
Source: made by the authors

Рис. 2. Семенник потомства экспериментальной группы С‑25 мкг/кг. ИГХ-реакция на маркер Bcl‑2. Докраска ядер гематоксилином. ×100
Источник: выполнено авторами
Fig. 2. Testis of the experimental group offspring (C-25 µg/kg). IHC reaction to Bcl-2 marker. Nucleus staining with hematoxylin. ×100
Source: made by the authors

Рис. 3. Семенник потомства экспериментальной группы С‑40 мкг/кг. ИГХ-реакция на маркер Bcl‑2. Докраска ядер гематоксилином. ×100
Источник: выполнено авторами
Fig. 3. Testis of the experimental group offspring (C-40 µg/kg). IHC reaction to Bcl-2 marker. Nucleus staining with hematoxylin. ×100
Source: made by the authors

Таким образом, экспрессия маркера Bcl-2 при воздействии синтетического препарата синэстрола в дозах 25 и 40 мкг/кг показала, что количество позитивно окрашенных клеток в сперматогониях увеличилось на 8,6 и 9,4 % соответственно, по сравнению с интактной группой. При сравнительном анализе интактной группы с экспериментальными группами С-25 и С-40 экспрессия маркера Bcl-2 в клетках сперматоцитов и сперматозоидах различий не показала, наблюдалось незначительное увеличение позитивно-­окрашенных клеток в сперматидах. Показатель экспрессии маркера Bcl-2 в экспериментальных группах С-25 и С-40 уменьшился в клетках Лейдига на 56,0 (Р < 0,05) и 60,0 % (Р < 0,05) соответственно.

Заключение

Можно предполагать, что введение синтетического аналога эстрогена синэстрола в период закладки половых желез плода приводит к нарушению морфологии в семенниках во взрослом периоде. Показатель экспрессии маркера Bcl-2 в экспериментальных группах С-25 и С-40 уменьшился в клетках Лейдига, что вызвало апоптотическую гибель клеток, отвечающих за выработку мужского полового гормона тестостерона. Полученные результаты могут быть использованы при выборе оптимальных доз введения синтетического аналога эстрогена синестрола в пренатальный период.

 

^{1 Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному изучению новых фармакологических веществ. М.: Медицина, 2005. C. 49—51
2 Методические указания по изучению общетоксического действия фармакологических веществ / Е.В. Арзамасцев, Т.А. Гуськова, И.В. Березовская; под ред. Р.У. Хабриева. М.: Медицина, 2005. С. 41—54.
3 Гистологическая техника / В.В. Семченко, С.А. Барашкова, В.И. Ноздрин, В.Н. Артемьев. Омск: Омская областная типография, 2006. 290 с.}

Об авторах

Римма Тагировна Сулайманова

Университет «РЕАВИЗ»

Автор, ответственный за переписку.
Email: rimma2006@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-1658-9054

кандидат биологических наук, доцент, заведующая кафедрой медикобиологических дисциплин

Российская Федерация, г. Санкт-Петербург, ул. Калинина, д. 8

Андрей Николаевич Квочко

Ставропольский государственный аграрный университет

Email: kvochko@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4445-7638

доктор биологических наук, профессор, профессор РАН, заведующий кафедрой физиологии, хирургии и акушерства

Российская Федерация, г. Ставрополь, пер. Зоотехнический, д. 12

Список литературы

Дополнительные файлы

Нет дополнительных файлов для отображения