Molecular biological marker BCL-2: testis analysis in prenatal injection of estrogen to white laboratory mice

Full Text

Введение

В ветеринарной медицине в качестве одного из современных методов диагностики заболеваний животных применяется иммуногистохимическое исследование. Метод используется как в лечебной практике, так и в научных разработках при дифференциальной диагностике заболеваний опухолевой и неопухолевой природы [1].

Центральное место в изучении регуляции процесса апоптоза занимают молекулярные белки семейства Bcl-2, которые отражают синтетические процессы, протекающие в клетках и тканях органов человека и животных. Белки Bcl-2 находятся в постоянном динамическом равновесии, являются фактором выживания клеток органов, защищая ее от программированной гибели. В научных источниках считается, что соотношение активных форм белков Bcl-2 определяет равновесие между жизнью и смертью клетки [2–4].

Определение белков семейства Bcl-2 в клетках и тканях органов выполняют ИГХ-методом, основанным на детекции уровня белка в клетке и позволяющем выявить экспрессию Вcl-2 [5].

Уменьшение концентрации Bcl-2 приводит к апоптотической гибели клеток, тогда как сверхэкспрессия его защищает клетки от смерти. В свою очередь в структурах ядер органов ген Bcl-2 выполняет функцию негативного регулятора апоптоза [6].

Пренатальное влияние эстрогенов на ранних стадиях антенального развития, в особенности периода закладки репродуктивных органов приводит к нарушению разнообразных морфологических изменений в органах, проявляющихся в постнатальной жизни у разных видов животных, особенно при проведении искусственного осеменения [7–9].

Создание модели с экспериментальными животными — важный аспект клинических исследований, так как от качества исследуемой модели зависит обоснованность фундаментальных выводов, механизмов развития заболеваний, результатов доклинических испытаний используемых медикаментозных препаратов [10, 11].

Пренатальное экспериментальное исследование влияния и изучения последствий применения препаратов с эстрогенной активностью является актуальной и малоизученной научной проблемой.

Цель исследования — иммуногистохимический анализ маркера Bcl-2 при пренатальном воздействии различных доз синтетического аналога эстрогена синэстрола на семенники потомства белых беспородных лабораторных мышей.

Материалы и методы исследования

Эксперимент выполнен на самках (n = 36) и самцах (n = 9) белых лабораторных мышей массой 19…21 г. Экспериментальные животные содержались в стандартных условиях при круглосуточном доступе к воде и пище. Все эксперименты, уход и содержание осуществлялись в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета европейского союза по охране животных, используемых в научных целях. После фертилизации беременных самок разделили на 3 группы — одна интактная и две экспериментальные группы. Принимая во внимание физиологическую экспрессию гормонов мышей каждой самке в отдельности на стадии гестации Е 11.5 беременности в одно и тоже время суток, однократно, внутримышечно вводили различные дозы исследуемых препаратов. Интактная группа — без воздействия (n = 10). Первой экспериментальной группе С-25 (n = 13) вводили эстрогеновый препарат синестрол в виде 2 % масляного раствора в дозе 25 мкг/кг. Второй экспериментальной группе C-40 (n = 13) вводили эстрогеновый препарат синестрол в виде 2 % масляного раствора в дозе 40 мкг/кг. Расчеты эффективности доз препаратов проводили в соответствии с коэффициентом для перерасчета доз веществ в мкг/кг для мышей1 [12, 13]. Введение лекарственных средств в эксперименте проводили по Методическим рекомендациям изучения общетоксичского действия фармакологических веществ2. По пять экспериментальных животных, рожденных от самок каждой группы, оставляли с матерью до одного месяца, после чего полученное потомство (n = 15) — отдельно самцов и самок — отсаживали в клетки. По достижению половозрелого возрастапотомство выводили из эксперимента в фазу диэструса. Определяли эстральный цикл, используя влагалищные мазки, окрашенные по критериям M.C. Cora [14].

Иммуногистохимический анализ проводили на семенниках потомства белых лабораторных мышей, фиксацию и гистологическую проводку осуществляли по стандартной схеме. Подсчет структур семенников потомства производили под иммерсионным объективом на стандартных полях зрения 903.

Иммуногистохимическим методом определяли маркер ингибитора апоптоза Bcl-2. Анализ проводили на срезах с парафиновых блоков семенников потомства, предназначенных для стандартного морфологического исследования. Парафиновые срезы депарафинировали и регидратировали по стандартной методике, используя непрямую стрептавидин-­биотиновую систему детекции Leica BOND (Novocastra™, Германия) для мыши (Mouse Monoclonal Antibody Bcl-2 Oncoprotein. Клон N-19, разведение: 1:300) по рекомендации производителя Santa Cruz Biotechnology (США). Гистологические срезы толщиной 4 мкм окрашивали с помощью иммуногистостейнера Leica Microsystems Bond™ (Германия). В 10 полях зрения при увеличении x100 проводилась оценка окрашенных препаратов каждого образца с использованием светового микроскопа Leica. Среднее число положительных к антигенам клеток вычисляли соотношением с клетками, в которых эти антигены не определялись (на 100 просчитанных клеток).

Экспрессию маркера Bcl-2 оценивали в семенниках потомства: сперматогониях, сперматоцитах, сперматидах, сперматозоидах, клетках Лейдига.

Статистическую обработку осуществляли с использованием программы Statistica 7.0 (StatSoft, США). По каждому параметру вычисляли среднее арифметическое значение и его стандартную ошибку (М ± SD). Достоверность изменений оценивали с помощью метода Краскела — Уолиса, различия определяли при достигнутом уровне значимости Р < 0,05.

Результаты исследования и обсуждение

Результаты экспрессии маркера Bcl-2 семенников потомства лабораторных мышей при пренатальном введении синтетического препарата синэстрол приведены в таблице и на рис. 1–3.

Количество Bcl-2 иммунопозитивных клеток в семенниках потомства белых беспородных лабораторных мышей при пренатальном введении синтетического препарата синэстрол

Показатели	Интактная	С-25	С-40
Клетки сперматогониев в эпителии извитого семенного канальца	25,4 ± 1,8	27,6 ± 1,7	27,8 ± 1,5
Клетки сперматоцитов в эпителии извитого семенного канальца	29,2 ± 1,3	29,6 ± 2,1	29,4 ± 1,1
Клетки сперматид в эпителии извитого семенного канальца	24,8 ± 0,8	25,8 ± 0,8	26,0 ± 1,1
Клетки сперматозоидов в просвете извитого семенного канальца	119,4 ± 0,5	117,8 ± 0,9	116,9 ± 1,9
Клетки Лейдига в соединительнотканной строме между извитыми семенными канальцами	5,0 ± 0,7	2,2 ± 0,8*	2,0 ± 0,7*

Примечание. * Р < 0,05 в сравнении с интактной группой.

Number of Bcl-2 immunopositive cells in testes of outbred laboratory mice offspring after prenatal injection of Sinestrol synthetic drug

Indicators	Control	С-25	С-40
Spermatogonian cells in epithelium of convoluted seminiferous tubule	25.4 ± 1.8	27.6 ± 1.7	27.8 ± 1.5
Spermatocyte cells in epithelium of convoluted seminiferous tubule	29.2 ± 1.3	29.6 ± 2.1	29.4 ± 1.1
Spermatid cells in epithelium of convoluted seminiferous tubule	24.8 ± 0.8	25.8 ± 0.8	26.0 ± 1.1
Sperm cells in lumen of convoluted seminiferous tubule	119.4 ± 0.5	117.8 ± 0.9	116.9 ± 1.9
Leydig cells in connective tissue stroma between convoluted seminiferous tubules	5.0 ± 0.7	2.2 ± 0.8*	2.0 ± 0.7*

Note: *Р < 0.05 in comparison with the control group.

Показатель экспрессии маркера Bcl-2 в группах С-25 и С-40 увеличился в клетках сперматогониев в эпителии извитого семенного канальца на 8,6 и 9,4 % по сравнению с интактной группой, что согласуется с результатами зарубежных авторов [3, 5, 15]. В экспериментальных группах С-25 и С-40 в клетках сперматоцитов в эпителии извитого семенного канальца уровень экспрессии значимых различий не выявил. В клетках сперматидов в обеих экспериментальных группах произошло незначительно увеличение количества позитивно окрашенных клеток экспрессии маркера Bcl-2. В экспериментальных группах С-25 и С-40 в клетках сперматидов значимых различий в показателях экспрессии маркера Bcl-2 не было выявлено. Сравнительный анализ с интактной группой показал, что в экспериментальных группах С-25 и С-40 произошло статистически значимое уменьшение степени экспрессии маркера Bcl-2 количества позитивно окрашенных клеток Лейдига в слоях соединительной ткани между извитыми семенными канальцами на 56,0 (Р < 0,05) и 60,0 % (Р < 0,05) соответственно.

Рис. 1. Семенник потомства интактной группы. ИГХ-реакция на маркер Bcl‑2. Докраска ядер гематоксилином. ×100
Источник: выполнено авторами
Fig. 1. Testis of the intact group offspring. IHC reaction to Bcl-2 marker. Nucleus staining with hematoxylin. ×100
Source: made by the authors

Рис. 2. Семенник потомства экспериментальной группы С‑25 мкг/кг. ИГХ-реакция на маркер Bcl‑2. Докраска ядер гематоксилином. ×100
Источник: выполнено авторами
Fig. 2. Testis of the experimental group offspring (C-25 µg/kg). IHC reaction to Bcl-2 marker. Nucleus staining with hematoxylin. ×100
Source: made by the authors

Рис. 3. Семенник потомства экспериментальной группы С‑40 мкг/кг. ИГХ-реакция на маркер Bcl‑2. Докраска ядер гематоксилином. ×100
Источник: выполнено авторами
Fig. 3. Testis of the experimental group offspring (C-40 µg/kg). IHC reaction to Bcl-2 marker. Nucleus staining with hematoxylin. ×100
Source: made by the authors

Таким образом, экспрессия маркера Bcl-2 при воздействии синтетического препарата синэстрола в дозах 25 и 40 мкг/кг показала, что количество позитивно окрашенных клеток в сперматогониях увеличилось на 8,6 и 9,4 % соответственно, по сравнению с интактной группой. При сравнительном анализе интактной группы с экспериментальными группами С-25 и С-40 экспрессия маркера Bcl-2 в клетках сперматоцитов и сперматозоидах различий не показала, наблюдалось незначительное увеличение позитивно-­окрашенных клеток в сперматидах. Показатель экспрессии маркера Bcl-2 в экспериментальных группах С-25 и С-40 уменьшился в клетках Лейдига на 56,0 (Р < 0,05) и 60,0 % (Р < 0,05) соответственно.

Заключение

Можно предполагать, что введение синтетического аналога эстрогена синэстрола в период закладки половых желез плода приводит к нарушению морфологии в семенниках во взрослом периоде. Показатель экспрессии маркера Bcl-2 в экспериментальных группах С-25 и С-40 уменьшился в клетках Лейдига, что вызвало апоптотическую гибель клеток, отвечающих за выработку мужского полового гормона тестостерона. Полученные результаты могут быть использованы при выборе оптимальных доз введения синтетического аналога эстрогена синестрола в пренатальный период.

 

^{1 Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному изучению новых фармакологических веществ. М.: Медицина, 2005. C. 49—51
2 Методические указания по изучению общетоксического действия фармакологических веществ / Е.В. Арзамасцев, Т.А. Гуськова, И.В. Березовская; под ред. Р.У. Хабриева. М.: Медицина, 2005. С. 41—54.
3 Гистологическая техника / В.В. Семченко, С.А. Барашкова, В.И. Ноздрин, В.Н. Артемьев. Омск: Омская областная типография, 2006. 290 с.}

About the authors

Rimma T. Sulaimanova

Reaviz University

Author for correspondence.
Email: rimma2006@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-1658-9054

Сandidate of Biological Sciences, Associate Professor, Head of the Department of Medical and Biological Disciplines

8/2 Kalinina st., Saint Petersburg, 198095, Russian Federation

Andrey N. Kvochko

Stavropol State Agrarian University

Email: kvochko@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4445-7638

Doctor of Biological Sciences, Professor, Professor of the Russian Academy of Sciences, Head of the Department of Physiology, Surgery and Obstetrics

12 Zootekhnichesky lane, Stavropol, 355017, Russian Federation

References

Supplementary files

There are no supplementary files to display.