Влияние полиморфизма гена LGB на показатели молочной продуктивности коров холмогорской породы

Полный текст

Введение

Перерабатывающие предприятия молочной промышленности в Архангельской области заинтересованы в закупке качественного сырья для производства белково-­молочной продукции, что в свою очередь мотивирует производителей молока изучать и использовать современные молекулярно-­генетические диагностические методы в животноводстве для обнаружения предпочтительных генотипов животных, положительно влияющих на технологические свой­ства молока.

Одним из актуальных вопросов молочного скотоводства является увеличение количественных показателей молочной продуктивности и повышение качественных характеристик молока, от которых зависит дальнейшая рентабельность предприятий перерабатывающей промышленности и, как следствие, соотношение цена — качество конечных продуктов. Интеграция молекулярно-­генетических методов в селекционную работу позволит оценить эти ресурсы непосредственно на уровне ДНК и мобилизовать их. Использование информации о полиморфизме генов молочной продуктивности может способствовать реализации генетических ресурсов животных.

Белок β-лактоглобулин — один из сывороточных молочных белков, составляющий до 12 % от их общего количества, традиционно учитываемого как качественный показатель молока [1]. Открытие полиморфизма гена LGB, кодирующего аминокислотную последовательность β-лактоглобулина, спровоцировало множество исследователей сделать его основным предметом своей научной деятельности. Целью этих работ ставилась оценка влияния полиморфизмов на конечные количественные и качественные, лактационные и технологические показатели молочной продуктивности [2–8]. В силу большей частоты встречаемости, наиболее изученными из полиморфных форм являются аллели A и B [9, 10].

Таким образом, сформировано следующее представление о влиянии этих аллелей на показатели молочной продуктивности: аллель A в большей степени влияет на количественные показатели, и в первую очередь на удой; а аллель B — на качественные и технологические характеристики молока, такие как повышенное содержание молочного белка и жира, а также содержание сухих веществ в молоке и коагуляционные свой­ства. Однако зачастую результаты исследований рознятся, что можно связать со следующими факторами: различные условия содержания скота; уникальные генетические особенности как отдельного животного, так и породы в целом; различные научные подходы к проведению исследования и методологические базы [11, 12].

Тем не менее, выявляются некоторые общие закономерности: большинство исследователей показывают рост величины удоев у животных с генотипом AA, при этом наибольшие значения содержания белка и жира в молоке установлены у животных с гомозиготным генотипом BB. В связи с тем, что полиморфизмы гена LGB могут оказывать различное влияние на молочную продуктивность крупного рогатого скота (КРС) в зависимости от аллеля и породы, проведение данных исследований становится актуальным.

Цель исследования — определить полиморфизм гена бета-лактоглобулина у коров холмогорской породы и выявить его влияние на хозяйственно-­ценные показатели молока. На основе установленных закономерностей можно целенаправленно формировать генофонды молочного поголовья холмогорской породы КРС с требуемыми показателями молочной продуктивности.

Материалы и методы исследования

Исследования проводили на маточном поголовье КРС холмогорской породы АО «Холмогорский Племзавод». Всего отобрали 209 образцов крови: кровь, полученную из яремной вены животных, отбирали в пробирки с ЭДТА до конечной концентрации 100 мМ. Экстракцию ДНК проводили по ручной методике с использованием центрифугирования набора реагентов «МагноПрайм ВЕТ» (НекстБио). Аллель A и B гена LGB определяли ПЦР ПДРФ методом с использованием эндонуклеазы рестрикции Hae III (табл. 1–3). Визуализацию результатов рестрикции осуществляли путем электрофоретического разделения в 3% агарозном геле в течение 80 минут при напряжении электрического поля в 100 В.

Таблица 1. Смесь для амплификации на основе набора для проведения ПЦР с HS-Taq (+MgCl₂) (Биолабмикс)

Компонент смеси	Объем, мкл
5 × ПЦР буфер (+MgCl2)	5,0
50 × смесь dNTP	0,5
Прямой праймер (Синтол), 10 мкМ GTCCTTGTGCTGGACACCGACTACA	1,2
Обратный праймер (Синтол), 10 мкМ CAGGACACCGGCTCCCGGTATATGA	1,2
ДНК-матрица	2,0
HS-Taq DNA-полимераза, 5 ед. акт./мкл	0,5
Стерильная вода	14,6

Table 1. Amplification mixture based on the PCR kit with HS-Taq (+MgCl₂) (Biolabmix)

Components	Volume, μL
5 × PCR buffer (+MgCl2)	5.0
50 × dNTP mixture	0.5
Direct primer GTCCTTGTGCTGGACACCGACTACA (Synthol), 10 μmol	1.2
Reverse primer CAGGACACCGGCTCCCGGTATATGA (Synthol), 10 μmol	1.2
DNA template	2.0
HS-Taq DNA polymerase, 5 U/μL	0.5
Sterile water	14.6

Таблица 2. Процедура амплификации с горячим стартом

Стадия	Режим	Повторность
Первичная денатурация	5 мин при 95 °C	1
Денатурация	40 с при 95 °C	38
Отжиг	40 с при 60 °C
Элонгация	40 с при 72 °C
Заключительная элонгация	10 мин при 72 °C	1

Table 2. Hot Start amplification procedure

Stage	Mode	Replication
Primary denaturation	5 min at 95 °C	1
Denaturation	40 sec at 95 °C	38
Annealing	40 sec at 60 °C
Elongation	40 sec at 72 °C
Final elongation	10 min at 72 °C	1

Таблица 3. Смесь для рестрикции на основе набора эндонуклеазы рестрикции Hae III (SibEnzyme)

Компонент смеси	Объем, мкл
10 × SE-буфер G	2
Эндонуклеаза рестрикции Hae III, 10000 е. а./мл	1
Амплификат ДНК-матрицы	8
Стерильная вода	9

Table 3. Restriction mixture based on Hae III restriction endonuclease kit (SibEnzyme)

Components	Volume, μL
10 × SE-buffer G	2
Hae III restriction endonuclease, 10000 U/mL	1
Amplicon of DNA template	8
Sterile water	9

Для статистической обработки данных использовали расчетные формулы.

Частоту встречаемости генотипов рассчитывали по формуле

${p=\frac{n}{N}}$ ,               (1)

где p — частота определенного генотипа; n — количество особей, имеющих определенный генотип; N — общее число особей.

Также определяли частоту встречаемости отдельных аллелей по формуле

${p_A=\frac{2n_{AA}+n_{AB}}{2N}}$ ,               (2)

где р_А — частота встречаемости аллеля А; n_АА, n_АВ — количество животных, несущих аллель А; N — общее число животных.

Состояние генного равновесия определяли с помощью закона Харди — Вайнберга.

Ожидаемую гетерозиготность рассчитывали по формуле

${He = 1 -(p^2 + q^2)}$ ,                (3)

где Не — ожидаемая гетерозиготность; р — частота аллеля А; q — частота аллеля В.

Для сопоставления фактического и ожидаемого распределения частот генотипов использовали критерий соответствия хи-квадрат:

${ χ^2=\sum \frac{(p_{эмп}- p_{теор})^2}{p_{теор}}}$ ,                (4)

где χ² — отклонение эмпирического распределения частот генотипов от теоретического; p_эмп — фактическое количество особей данного генотипа; p_теор — теоретически ожидаемое количество особей данного генотипа.

Статистический анализ данных осуществлялся в программе Microsoft Excel 2021. Для анализа различий между показателями в сравнительных группах применялся параметрический t-критерий Стьюдента. Результаты представлены в виде Ме ± m (ошибка среднего и стандартное отклонение). Критический уровень р при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05.

Результаты исследования и обсуждение

При проведении ПЦР-ПДРФ методики с использованием эндонуклеазы рестрикции Hae III в зависимости от генотипа исследуемого животного по гену LGB образуются фрагменты 153, 109 и 79/74 п.н. Генотипу LGB^АА соответствует наличие двух фрагментов длиной 153 и 109 п.н., для генотипа LGB^ВВ — наличие двух фрагментов длиной 109 и 79/74 п.н., а для LGB^АВ — все три фрагмента 153, 109 и 79/74 п.н. [13].

Мы определяли генотип LGB у 209 особей маточного поголовья холмогорской породы АО «Холмогорский Племзавод». В исследуемой выборке выявили все три генотипа LGB аллелей А и В (рис.). Общая генетическая структура поголовья представлена далее (табл. 4).

Визуализация результатов ПЦР-ПДРФ гена LGB: М — ДНК-маркер; 1, 9, 18 — генотип АА; 2, 6, 7, 10, 13, 15, 23–28 — генотип АВ; 3–5, 8, 11, 12, 14, 16, 17, 19–22, 29, 30 — генотип ВВ
Источник: фото выполнили Н.А. Худякова, Е.Н. Щипакова, А.С. Кашин с помощью системы гель-документирования «Взгляд»
Visualization of PCR-PDRF results of the LGB gene: M-DNA marker; 1, 9, 18 — AA genotype; 2, 6, 7, 10, 13, 15, 23–28 — genotype AB; 3–5, 8,11–12, 14, 16–17, 19–22, 29–30 — BB genotype
Source: photo taken by N.A. Khudyakova, E.N. Shchipakova, A.S. Kashin using the ‘Vzglyad’ gel documentation system

Таблица 4. Полиморфизм локуса бета-лактоглобулина у коров холмогорской породы

Показатель	n	Частота встречаемости генотипов						Частота встречаемости аллелей, %		χ²
		АА		АВ		ВВ		А	В
		n	%	n	%	n	%
Наблюдаемое распределение	209	18	8,6	99	47,4	92	44,0	32	68	1,445
Ожидаемое распределение		22	10,4	91	43,7	96	45,8

Table 4. Polymorphism of β-lactoglobulin locus in Kholmogorsky cows

Parameter	n	Frequency of genotype occurrence						Frequency of alleles occurrence, %		χ²
		AA		AB		BB		A	B
		n	%	n	%	n	%
Observed distribution	209	18	8.6	99	47.4	92	44.0	32	68	1.445
Expected distribution		22	10.4	91	43.7	96	45.8

Выявлено доминирование аллеля В гена LGB в генофонде исследуемой выборки коров и его частота встречаемости, равная 68 %. Соответственно, частота встречаемости аллеля А составила 32 %. При этом самым распространенным генотипом оказался АВ — 47,4 % (99 из 209 голов).

При оценке наблюдаемого и ожидаемого распределения генотипов гена LGB по закону Харди — Вайнберга разница между АА-, АВ- и ВВ-генотипами соответствовала средним значениям — 1,8…3,7 %. Значение вариабельности хи-квадрат χ² по гену LGB — 1,445, что меньше его стандартного значения 9,2. Исходя из этого, можно сделать вывод о сбалансированном состоянии генного равновесия по гену бета-лактоглобулина.

Для выявления взаимосвязи разных генотипов LGB и показателей молочной продуктивности коров холмогорской породы сформировали подгруппы животных по последней завершенной лактации в зависимости от генотипов и сравнены между собой (табл. 5).

Таблица 5. Молочная продуктивность животных с разными генотипами LGB по последней законченной лактации

Показатель		Удой за 305 дней лактации, кг	Массовая доля жира (МДЖ), %	Количество молочного жира, кг	Массовая доля белка (МДБ), %	Количество молочного белка, кг
1 лактация (n = 42)	АА (n = 6)	5317  ±  323*	3,67 ± 0,16*	195  ±  8	3,17 ± 0,04	169 ± 12*
	АВ (n = 22)	6356  ±  232*/*	3,86 ± 0,10	246 ± 12	3,16 ± 0,04	201 ± 8*
	ВВ (n = 14)	5465  ±  276*	4,15 ± 0,13*	227 ± 18	3,28 ± 0,05	179 ± 9
2 лактация (n = 6)	АВ (n = 3)	6818 ± 497	4,07 ± 0,07	277 ± 19	3,17 ± 0,11	216 ± 9
	ВВ (n = 3)	6797 ± 658	4,13 ± 0,25	281 ± 44	3,07 ± 0,10	209 ± 22
3 и более лактации (n = 88)	АА (n = 8)	7108 ± 338	3,76 ± 0,13	267 ± 15	3,02 ± 0,05	215 ± 13
	АВ (n = 41)	7032 ± 161	4,12 ± 0,10	290 ± 9	3,05 ± 0,03	215 ± 5
	ВВ (n = 39)	6844 ± 168	3,99 ± 0,09	273 ± 8	3,09 ± 0,03	211 ± 6
Итог (n = 136)	АА (n = 14)	6340 ± 335	3,73 ± 0,10*	236 ± 13*	3,08 ± 0,04	195 ± 11
	АВ (n  =  66)	6797 ± 134	4,04 ± 0,07	274 ± 7	3,09 ± 0,02	210 ± 4
	ВВ (n = 56)	6496 ± 161	4,03 ± 0,07*	262 ± 8*	3,13 ± 0,03	203 ± 5

Примечание. Различия достоверны по t-критерию Стьюдента * — р ≤ 0,05. Полужирным начертанием выделены наибольшие показатели молочной продуктивности в подгруппе.

Table 5. Productivity of dairy animals with different LGB genotypes according to the last completed lactation

Parameter		Milk yield for 305 days of lactation, kg	Mass fraction of fat, %	Amount of milk fat, kg	Mass fraction of protein, %	Amount of milk protein, kg
1st lactation (n = 42)	АА (n = 6)	5317 ± 323*	3.67 ± 0.16*	195 ± 8	3.17 ± 0.04	169 ± 12*
	АВ (n = 22)	6356 ± 232*/*	3.86 ± 0.10	246 ± 12	3.16 ± 0.04	201 ± 8*
	ВВ (n = 14)	5465 ± 276*	4.15 ± 0.13*	227 ± 18	3.28 ± 0.05	179 ± 9
2nd lactation (n = 6)	АВ (n = 3)	6818 ± 497	4.07 ± 0.07	277 ± 19	3.17 ± 0.11	216 ± 9
	ВВ (n = 3)	6797 ± 658	4.13 ± 0.25	281 ± 44	3.07 ± 0.10	209 ± 22
3 or more lactations (n = 88)	АА (n = 8)	7108 ± 338	3.76 ± 0.13	267 ± 15	3.02 ± 0.05	215 ± 13
	АВ (n = 41)	7032 ± 161	4.12 ± 0.10	290 ± 9	3.05 ± 0.03	215 ± 5
	ВВ (n = 39)	6844 ± 168	3.99 ± 0.09	273 ± 8	3.09 ± 0.03	211 ± 6
Total (n = 136)	АА (n = 14)	6340 ± 335	3.73 ± 0.10*	236 ± 13*	3.08 ± 0.04	195 ± 11
	АВ (n = 66)	6797 ± 134	4.04 ± 0.07	274 ± 7	3.09 ± 0.02	210 ± 4
	ВВ (n = 56)	6496 ± 161	4.03 ± 0.07*	262 ± 8*	3.13 ± 0.03	203 ± 5

Note. The differences are significant according to the Student’s t-test * — p ≤ 0.05. The highest indicators of milk productivity in the subgroup are highlighted in bold.

В исследуемую выборку животных входило 136 коров с завершенной лактацией, 42 из которых лактировали впервые, 6 — во второй раз и 88 — в третий и более раз.

В первой подгруппе животных (1-я лактация) преобладали коровы с генотипом АВ (n = 22), реже встречались коровы с генотипом ВВ (n = 14), наименьшая численность была у коров с генотипом АА (n = 6). Наилучшие показатели по удою за 305 дней лактации установили у особей с LGB^АВ — 6356 кг, что на 1042 кг больше (р ≤ 0,05), чем у коров с LGB^АА, и на 891 кг больше (р ≤ 0,05), чем с LGB^ВВ. Также количество молочного жира и молочного белка было наибольшим у представителей генотипа АВ — 246 кг и 201 кг соответственно. При этом показатели МДЖ и МДБ преобладали у коров с ВВ — 4,15 и 3,28 % соответственно.

Вторая подгруппа (2-я лактация) была наименьшей по численности (n = 6) и в ее состав входило 3 представителя LGB^АВ и 3 представителя LGB^ВВ. Показатели по удою за 305 дней лактации, МДБ и количеству молочного белка были выше у коров с генотипом АВ. Остальные показатели (МДЖ и количество молочного жира) наоборот оказались больше у коров с генотипом ВВ.

Третья подгруппа (3-я и более лактация) была самой многочисленной в исследуемой выборке — 88 голов. По генетической структуре разделение было следующим: LGB^АА — 8 голов, LGB^АВ — 41 голова и LGB^ВВ — 39 головы. Удой за 305 дней лактации был больше у коров с генотипом АА — 7108 кг. МДЖ, количество молочного жира и молочного белка наибольшими были у представительниц генотипа АВ — 4,12 %, 290 кг и 215 кг соответственно. При этом МДБ выше у коров с ВВ — 3,09 %.

В общей сумме в исследуемой выборке коров с завершенной лактацией присутствовало 14 голов с генотипом АА, 66 голов — АВ и 56 голов — ВВ. Наибольшие показатели молочной продуктивности выявлены у коров с генотипом АВ: удой — 6797 кг, МДЖ — 4,04 %, количество молочного жира — 274 кг и количество молочного белка — 210 кг. За исключением показателя МДБ, который лучше проявился у коров с ВВ — 3,13 %.

Холмогорская порода — одна из самых широко распространенных и используемых отечественных пород. Эти животные являются непревзойденными производителями молока в условиях сурового климата северных регионов России [14]. Скорее всего, уникальность этой породы, выраженная не только в показателях молочной продуктивности, экстерьера и конституции, но и в генофонде, повлияла на расхождение полученных результатов с общими закономерностями. Во-первых, в нашем случае, аллель B положительно влияет не только на качественные и технологические характеристики молока, но и на количественные показатели молочной продуктивности. Во-вторых, наибольшая величина удоя и массовой доли сухих веществ принадлежит животным с генотипом AB.

Заключение

Выявлено влияние полиморфизма гена LGB на хозяйственно-­ценные показатели молочной продуктивности маточного поголовья КРС холмогорской породы АО «Холмогорский Племзавод». Установлено доминирование B аллеля в генофонде поголовья, ассоциируемое с увеличением этих показателей. При этом наибольшую величину этих показателей обеспечивает экспрессия гетерозиготного генотипа AB.

Для дальнейшего планирования селекционно-­племенной работы особенно интересно установление ассоциативных связей генотипов гена LGB c показателями молочной продуктивности именно на период 3-й и более лактации, так как именно в данный период корова достигает максимальной молочности и окупает произведенные на нее затраты. При сопоставлении результатов ежемесячного производственного контроля качества молока с генотипом гена LGB соответствующих молочных коров выявлены следующие тенденции: экспрессия генотипа AA связана с повышением удоя, так удой коров с LGB^АА составил 7108 кг, что на 1,1 % больше, чем у коров с LGB^АВ (7032 кг), и на 3,9 % — чем у коров с LGB^ВВ (6844 кг); экспрессия генотипа AB связана с повышением МДЖ в молоке, так МДЖ в молоке коров с LGB^АВ составила 4,12 %, что на 9,6 % превышает показатели коров с LGB^АА (3,76 %) и на 3,3 % — с LGB^ВВ (3,99 %); экспрессия генотипа BB связана с повышением МДБ в молоке, МДБ в молоке коров с LGB^ВВ составила 3,09 %, данное значение больше на 2,3 % показателей коров с LGB^АА (3,02 %) и на 1,3 % — с LGB^ВВ (3,05 %).

Общая картина по стаду представлена следующими тенденциями: экспрессия генотипа AB связана с повышением удоя, удой от коров с LGB^АВ составил 6797 кг, что на 6,6 % больше, чем у коров с LGB^АА (6340 кг) и на 4,0 % чем у коров с LGB^ВВ (6496 кг), а также с повышением МДЖ в молоке. МДЖ молока коров с LGB^АВ составила 3,73 %, что превышает данный показатель в молоке коров с LGB^АА (3,73 %) и с LGB^ВВ (4,03 %) на 8,3 и 0,2 % соответственно; экспрессия генотипа BB связана с повышением МДБ в молоке, так МДБ молока коров с LGB^ВВ составила 3,13 %, что больше на 1,6 %, чем в молоке коров с LGB^АА (3,08 %), и на 1,3 %, чем в молоке коров с LGB^АВ (3,09 %).

Рекомендуется включение процедуры оценки полиморфизма гена LGB в комплекс мероприятий селекционной-­производственной работы для повышения экономической эффективности предприятия. Подобный шаг также поспособствует дальнейшему, более комплексному изучению этого гена как селекционного маркера.

Об авторах

Наталья Александровна Худякова

Федеральный исследовательский центр комплексного изучения Арктики им. академика Н.П. Лавёрова Уральского отделения Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: nata070707hudyakova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1302-2965
SPIN-код: 3906-2286

кандидат сельскохозяйственных наук, научный сотрудник лаборатории инновационных технологий в АПК

Российская Федерация, 163032, г. Архангельск, п. Луговой, д. 10

Екатерина Николаевна Щипакова

Федеральный исследовательский центр комплексного изучения Арктики им. академика Н.П. Лавёрова Уральского отделения Российской академии наук

Email: schipakova.katerina@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0007-6952-9665
SPIN-код: 8931-0882

младший научный сотрудник лаборатории инновационных технологий в АПК

Российская Федерация, 163032, г. Архангельск, п. Луговой, д. 10

Андрей Сергеевич Кашин

Федеральный исследовательский центр комплексного изучения Арктики им. академика Н.П. Лавёрова Уральского отделения Российской академии наук

Email: a9523005321@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0004-1155-0339
SPIN-код: 8130-4713

младший научный сотрудник лаборатории инновационных технологий в АПК

Российская Федерация, 163032, г. Архангельск, п. Луговой, д. 10

Список литературы

Дополнительные файлы