Genotypic clustering of 51 soybean cultivars and wild forms using SSR-markers

Alena A. Ivaniy; Иваний Алена Андреевна; Andrey A. Penzin; Пензин Андрей Андреевич; Olga N. Bondarenko; Бондаренко Ольга Николаевна; Anastasia A. Blinova; Блинова Анастасия Андреевна; Alina E. Gretchenko; Гретченко Алина Евгеньевна; Lyubov E. Ivachenko; Иваченко Любовь Егоровна; Pavel D. Timkin; Тимкин Павел Дмитриевич

doi:10.22363/2312-797X-2025-20-1-88-101

Генотипическая кластеризация 51 сорта культурной и форм дикой сои с использованием SSR-маркеров

Авторы: Иваний А.А.¹, Пензин А.А.¹, Бондаренко О.Н.¹, Блинова А.А.¹, Гретченко А.Е.¹, Иваченко Л.Е.¹, Тимкин П.Д.¹
Учреждения:
1. Федеральный научный центр «Всероссийский научно-исследовательский институт сои»
Выпуск: Том 20, № 1 (2025): Терапевтический кейс благополучия животных
Страницы: 88-101
Раздел: Генетика и селекция растений
URL: https://agrojournal.rudn.ru/agronomy/article/view/20170
DOI: https://doi.org/10.22363/2312-797X-2025-20-1-88-101
EDN: https://elibrary.ru/HYSNGO
ID: 20170

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Сорта сои характеризуются в основном морфологическими и биохимическими признаками. Однако при попытке использовать данные параметры в идентификации и дифференциации сортов исследователи сталкиваются с затруднениями, что усложняет работу с близкородственными сортовыми линиями. Микросателлитные маркеры, или SSR (простые повторы последовательности), являются отличным инструментом для идентификации и дифференциации сортов, выявления степени их генетического родства и защите авторских прав. Цель исследования - получение молекулярно-генетических формул для сортов культурной и форм дикой сои с последующим выявлением их генетического родства. Материалом исследования служил 51 образец культурной и дикой сои (39 культурных сортов сои селекции ФГБНУ ФНЦ ВНИИ сои и 12 форм дикой сои). Из исследуемых образцов выделялось геномная ДНК, которая затем была амплифицирована. Полученные ампликоны разделили в 2%-м агарозном геле и детектировали длину получившихся фрагментов в двух повторностях. Для молекулярно-генетической характеристики использовали 9 микросателлитных локусов ( Satt1 , Satt2 , Satt5 , Satt9 , Soyhsp176 , Satt681 , Sat_263 , Satt141 , Satt181 ) . Результаты, демонстрирующие длину каждого локуса, проанализировали алгоритмом UPGMA для регистрации генетического родства или отдаленности. Получены молекулярногенетические формулы исследуемых образцов, которые в дальнейшем можно использовать для составления генетических паспортов. На основе алгоритма UPGMA 51 генотип сои сгруппировали в 13 основных кластеров. Большинство форм дикой сои, произрастающих в Амурской области, продемонстрировали генетическую близость благодаря принадлежности к трем близко расположенным кластерам. Однако форма дикой сои из Хабаровского края (Дикая соя 31) и одна из форм Амурской области (КЗ-6337), не входящая в указанные кластеры, оказались генетически отдалены от других групп дикой сои. Эти результаты свидетельствуют об адекватности использования 9 SSR-локусов для задач идентификации, выявления родства и дальнейшей паспортизации сои.

Ключевые слова

Glycine max, Glycine soja, SSR-анализ, ДНК-маркеры, микросателлитные локусы, молекулярно-генетическая паспортизация

Полный текст

Введение

Идентификация сортов сои — важная задача в прикладной селекции, семеноводстве, торговле и т. д. Решение такой задачи возможно с использованием двух методов: оценки морфологических признаков и анализа молекулярно-генетических маркеров. Методы не взаимоисключают, а дополняют друг друга [1, 2]. Несмотря на то, что для проверки однородности и стабильности растений используют морфологические признаки, последние не подходят для селекции с узким генетическим разнообразием. На сегодняшний день исследователи сосредоточены на применении молекулярных маркеров.

Благодаря молекулярным маркерам идентификация и дифференциация различных сортов растений становятся менее затратными по времени и более простыми [3, 4]. Для поиска молекулярно-генетических маркеров широко используется платформа секвенирования нового поколения (NGS). Маркеры для генетического изучения культурных растений могут быть представлены простыми повторами последовательностей (SSR), однонуклеотидными полиморфизмами (SNP), полиморфизмами длин рестрикционных фрагментов (RFLP), полиморфизмами длин амплифицированных фрагментов (AFLP), вставками/делециями (InDels) и др. [5–7].

Микросателлиты (SSR) встречаются в геномах большинства эукариот и являются очень информативными, многоаллельными и воспроизводимыми. Метод SSR-анализа является наиболее перспективным и пригодным для практического использования, благодаря таким критериям, как высокая точность и надежность результатов [8–10].

Цель исследования — получение молекулярно-генетических формул для сортов культурной и форм дикой сои с последующим выявлением их генетического родства.

Материалы и методы исследования

Материалом для исследования были семена культурных сортов сои селекции ВНИИ сои и формы дикой сои, ареал которых Амурская область (КЗ‑6337, КБл‑29, КА‑1413, КА‑32, КБел‑72, КБл‑24, КА 346, КТ‑156, КЗ‑578, КБл‑90, КБл‑77) и Хабаровский край (Дикая соя 31).

Геномную ДНК выделяли с использованием коммерческого набора ДНК-экстран‑3 (ООО «Синтол», Россия) по протоколу, приложенному к реактивам, из семян сои с модификацией. Для проведения исследований отбирали по 6 семян сои и замачивали их в дистиллированной воде при +25 °C в течение суток. Далее семена подвергали шоковой заморозке в течение 30 минут при температуре –86 °C. Затем из каждого семени отбирали навеску 0,025 г [11].

Степень очистки и концентрацию ДНК определяли на спектрофотометре EZdrop (Китай). Пределы измерения концентрации брали от 50 до 200 нг/мкл. Образцы считались чистыми при соотношении длин волн 260/280, равных 1,8 ± 0,1. Для амплификации выделенной ДНК форм дикой сои и сортов культурной сои применяли 9 пар праймеров к SSR-локусам (Satt1, Satt2, Satt5, Satt9, Soyhsp176, Satt681, Sat_263, Satt141, Satt181), отобранных на основании литературных источников [12–14]. ПЦР проводили в 2‑кратной повторности. Для каждой из представленных пар праймеров рассчитали температуру отжига (в веб-версии программы PrimerBLAST) и провели их оптимизацию экспериментальным путем (табл. 1). В этих целях с каждой парой праймеров проводили ПЦР, где ДНК образцов сои амплифицировали по установленному протоколу, изменяя температуру отжига в каждом опыте на 3…5 °C. Выбор оптимального значения температуры отжига основывался на получении четких, хорошо различимых амплифицированных фрагментов в характерном для каждого локуса диапазоне количества пар нуклеотидов (н.п). В таком случае температуру, при которой получались хорошо различимые ампликоны, называли фактической. Амплификацию ДНК сои на амплификаторе CFX96 (Real-time) (Bio-Rad laboratories Inc., США) выполняли в 50 мкл готовой реакционной смеси расширенного набора для проведения ПЦР с HS-Taq (ООО «Биолабмикс»). Продукты реакции разделяли методом электрофореза в 2%-м агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, в 0,5 × ТВЕ буфере.

Анализ и визуализацию осуществляли с использованием гель-документирующей системы GelDoc EZ (Bio-Rad laboratories Inc., США). Для анализа молекулярной массы использовали готовый набор ДНК (DNA Ladder, 50+bp). Идентификацию и определение размеров аллелей микросателлитных локусов проводили с использованием программы Image Lab Version 6.0.1 4 Standard Edition. Аллельное состояние каждого локуса обозначали в соответствии с размером продуктов амплификации — пар нуклеотидов (н. п.). Статистическую обработку полученных данных осуществляли с применением пакета программы POPGENE версии 1.32 [15]. Для визуализации обнаруженных генетических дистанций между исследуемыми образцами построили дендрограмму методом невзвешенного попарно-группового анализа (unweighted pair wise group method analysis — UPGMA).

Таблица 1
Оптимальная температура отжига праймеров

Наименование локуса	Температура отжига, °C
Наименование локуса	Фактическая	Расчетная
Satt1	60	60
Satt2	60	63
Satt5	55	58
Satt9	45	61
Soyhsp176	60	67
Satt681	58	65
Sat_263	65	56
Satt141	63	60
Satt181	63	50

Источник: составлено О.Н. Бондаренко, А.А. Пензиным на основе экспериментальных данных.

Table 1
Optimum annealing temperature

Locus	Annealing temperature, °C
Locus	Actual	Calculated
Satt1	60	60
Satt2	60	63
Satt5	55	58
Satt9	45	61
Soyhsp176	60	67
Satt681	58	65
Sat_263	65	56
Satt141	63	60
Satt181	63	50

Source: compiled by O.N. Bondarenko, A.A. Penzin based on experimental data.

Результаты исследования и обсуждение

В ходе исследования получены длины всех микросателлитных локусов для каждого сорта культурной и форм дикой сои и составлены молекулярно-генетические формулы, отображающие длину аллелей (табл. 2), которые позволят использовать их при регистрации сортов, а также для дальнейшей паспортизации и защиты прав селекционеров.

Таблица 2
Молекулярно-генетические формулы 51 генотипа сои, полученные путем микросателлитного анализа

№	Наименование сорта культурной / формы дикой сои	Формула*
1	Кружевница	А₁₃₇B₁₅₄C₁₅₀D₂₀₆H₁₁₅ J₂₄₄K₁₃₅L₁₄₈M₂₂₅
2	Сентябринка	A₁₄₅B₁₅₄C₁₃₆D₂₀₀H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₂₁₀M₂₀₈
3	Веретейка	A₁₃₇B₁₅₄C₁₅₀D₂₁₂H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₁₈₇M₂₂₅
4	Лидия	A₁₃₇B₁₅₄C₁₅₀D₁₈₆H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₁₈₇M₂₀₈
5	Умка	A₁₃₇B₁₅₄C₁₃₆D₁₅₉H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₁₈₇M₂₂₅
6	Даурия	A₁₄₅B₁₅₄C₁₅₀D₁₆₈H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₁₈₇M₂₁₈
7	Золушка	A₁₅₄B₁₅₄C₁₆₀D₁₇₆H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₂₁₀M₂₀₈
8	Лазурная	A₁₄₅B₁₅₄C₁₅₀D₁₅₄H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₂₁₀M₁₈₅
9	Топаз	A₁₄₅B₁₅₄C₁₃₆D₁₃₈H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₂₁₀M₁₇₀
10	Олимп	A₁₄₅B₁₅₄C₁₆₀D₁₈₆H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₂₁₀M₂₁₈
11	Ляна	A₁₄₅B₁₄₆C₁₆₀D₁₅₄H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₂₁₀M₁₈₅
12	Грэй	A₁₃₇B₁₄₆C₁₆₀D₁₈₆H₁₁₅J₂₄₄K₁₆₅L₂₁₀M₂₁₈
13	ВНИИС18	A₁₄₅B₁₄₆C₁₆₀D₁₈₆H₁₁₅J₂₄₄K₁₅₆L₂₁₀M₂₀₈
14	Алпетра	A₁₄₅B₁₄₆C₁₆₀D₁₈₆H₁₂₀J₂₄₄K₁₆₅L₂₁₀M₂₀₈
15	Золотница	A₁₃₇B₁₅₄C₁₆₀D₂₁₂H₁₁₅J₂₄₄K₁₅₆L₂₁₀M₁₇₀
16	Апис	A₁₂₅B₁₅₄C₁₆₀D₂₁₂H₁₁₅J₂₄₄K₁₅₆L₂₁₀M₂₀₈
17	Лучистая	A₁₂₅B₁₄₆C₁₆₀D₂₁₂H₁₁₅J₂₄₄K₁₅₆L₂₁₀M₂₀₈
18	Тисей	A₁₂₅B₁₄₆C₁₆₀D₂₀₆H₁₁₅J₂₄₄K₁₈₀L₂₁₀M₂₀₈
19	Пепелина	A₁₃₇B₁₅₄C₁₆₀D₁₆₈H₁₁₅J₂₄₄K₁₅₆L₂₁₀M₂₀₈
20	Чародейка	A₁₅₄B₁₆₃C₁₆₀D₁₈₆H₁₁₅J₂₀₀K₁₆₅L₂₁₀M₂₀₈
21	Персона	A₁₂₅B₁₄₆C₁₆₀D₂₁₂H₁₀₅J₂₂₀K₁₃₅L₁₈₇M₁₇₅
22	Статная	A₁₂₅B₁₄₆C₁₆₅D₂₁₂H₁₀₅J₂₂₈K₁₃₅L₁₈₇M₁₇₀
23	Евгения	A₁₄₅B₁₅₄C₁₇₅D₂₁₂H₁₀₅J₂₂₈K₁₃₅L₁₈₇M₂₀₅
24	Журавушка	A₁₄₅B₁₅₄C₁₆₀D₂₂₀H₁₀₅J₂₂₀K₁₃₅L₁₈₇M₂₀₈
25	Бонус	A₁₃₇B₁₃₇C₁₇₅D₂₀₀H₁₀₅J₂₄₄K₁₅₆L₁₈₇M₁₉₅
26	Лебедушка	A₁₃₇B₁₄₆C₁₆₀D₁₂₀H₁₀₅J₂₂₀K₁₄₅L₁₈₇M₂₀₈
27	Куханна	A₁₃₇B₁₄₆C₁₈₅D₁₂₀H₁₀₅J₂₄₄K₁₃₅L₁₈₇M₂₀₈
28	МК 100	A₁₃₇B₁₄₆C₁₈₅D₂₀₆H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₁₈₇M₂₀₈
29	Невеста	A₁₃₇B₁₄₆C₁₈₅D₁₈₆H₁₁₅J₂₄₄K₁₅₆L₁₈₇M₂₀₈
30	Нега 1	A₁₃₇B₁₄₆C₁₇₅D₁₆₈H₁₁₅J₂₄₄K₁₄₅L₁₈₇M₁₉₅
31	Октябрь 70	A₁₄₅B₁₄₆C₁₈₅D₁₅₄H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₁₈₇M₂₀₈
32	Грация	A₁₃₇B₁₄₆C₁₆₅D₁₄₈H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₁₈₇M₁₈₅
33	Интрига	A₁₃₇B₁₄₆C₁₈₅D₂₀₀H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₁₈₇M₁₉₅
34	Ласточка	A₁₄₅B₁₅₄C₁₈₅D₂₁₂H₁₀₅J₂₄₄K₁₅₆L₂₁₀M₁₈₅
35	Татьяна	A₁₃₇B₁₃₇C₁₆₀D₂₁₂H₁₀₅J₂₅₆K₁₅₆L₁₈₇M₂₀₈
36	Гармония	A₁₅₄B₁₄₆C₁₇₅D₂₁₂H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₁₈₇M₂₁₈
37	Соната	A₁₅₄B₁₄₆C₁₇₅D₂₁₂H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₁₈₇M₂₀₈
38	Китросса	A₁₅₄B₁₄₆C₁₇₅D₁₇₆H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₁₈₇M₂₂₅
39	Алена	A₁₅₄B₁₃₇C₁₅₀D₁₆₈H₁₁₅J₂₀₀K₁₃₅L₁₈₇M₁₈₅
40	Дикая соя 31	A₁₃₇B₁₅₄C₁₈₅D₁₂₀H₁₂₆J₂₂₈K₁₃₅L₁₈₇M₁₇₀
41	КЗ‑6337	A₁₀₈B₁₄₆C₁₆₀D₁₈₆H₁₁₅J₂₀₀K₁₃₅L₁₄₈M₁₇₀
42	КБл‑29 ^[1]	A₁₄₅B₁₇₆C₁₇₅D₁₂₀H₁₂₆J₂₄₄K₁₆₅L₂₁₀M₂₀₈
43	КА‑14131	A₁₄₅B₁₇₆C₁₇₅D₁₂₀H₁₂₆J₂₄₄K₁₆₅L₂₁₀M₂₀₈
44	КА‑32	A₁₂₅B₁₇₆C₁₇₅D₁₂₀H₁₂₆J₂₄₄K₁₆₅L₂₁₀M₂₀₈
45	КБел‑72	A₁₄₅B₁₇₆C₁₆₀D₁₂₀H₁₂₆J₂₄₄K₁₆₅L₂₁₀M₂₀₈
46	КБл‑241	A₁₄₅B₁₇₆C₁₇₅D₁₂₀H₁₂₆J₂₄₄K₁₆₅L₂₁₀M₂₀₈
47	КА 3462	A₁₃₇B₁₇₆C₁₇₅D₁₃₈H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₂₁₀M₂₀₈
48	КТ‑156 ^[2]	A₁₃₇B₁₇₆C₁₇₅D₁₃₈H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₂₁₀M₂₀₈
49	КЗ‑5782	A₁₃₇B₁₇₆C₁₇₅D₁₃₈H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₂₁₀M₂₀₈
50	КБл‑90	A₁₂₅B₁₇₆C₁₇₅D₁₈₆H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₂₁₀M₂₀₈
51	КБл‑77	A₁₅₄B₁₇₆C₁₇₅D₁₃₈H₁₁₅J₂₄₄K₂₁₃₅L₂₁₀M₂₀₈

Примечание. *Код локуса A — Satt1, B — Satt2, C — Satt5, D — Satt9, H — Soyhsp176, J — Satt681, K — Sat_263, L — Satt141, M — Satt181.
Источник: составлено А.А. Иваний, А.А. Пензиным, О.Н. Бондаренко, П.Д. Тимкиным на основе экспериментальных данных.

Table 2
The molecular genetic formulas of 51 soy genotype obtained by microsatelite analysis

№	Soy culivar / wild form	Formula*
1	Kruzhevnitsa	А₁₃₇B₁₅₄C₁₅₀D₂₀₆H₁₁₅ J₂₄₄K₁₃₅L₁₄₈M₂₂₅
2	Sentyabrinka	A₁₄₅B₁₅₄C₁₃₆D₂₀₀H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₂₁₀M₂₀₈
3	Vereteika	A₁₃₇B₁₅₄C₁₅₀D₂₁₂H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₁₈₇M₂₂₅
4	Lidiya	A₁₃₇B₁₅₄C₁₅₀D₁₈₆H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₁₈₇M₂₀₈
5	Umka	A₁₃₇B₁₅₄C₁₃₆D₁₅₉H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₁₈₇M₂₂₅
6	Dauriya	A₁₄₅B₁₅₄C₁₅₀D₁₆₈H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₁₈₇M₂₁₈
7	Zolushka	A₁₅₄B₁₅₄C₁₆₀D₁₇₆H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₂₁₀M₂₀₈
8	Lazurnaya	A₁₄₅B₁₅₄C₁₅₀D₁₅₄H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₂₁₀M₁₈₅
9	Topaz	A₁₄₅B₁₅₄C₁₃₆D₁₃₈H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₂₁₀M₁₇₀
10	Olimp	A₁₄₅B₁₅₄C₁₆₀D₁₈₆H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₂₁₀M₂₁₈
11	Lyana	A₁₄₅B₁₄₆C₁₆₀D₁₅₄H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₂₁₀M₁₈₅
12	Grei	A₁₃₇B₁₄₆C₁₆₀D₁₈₆H₁₁₅J₂₄₄K₁₆₅L₂₁₀M₂₁₈
13	VNIIS18	A₁₄₅B₁₄₆C₁₆₀D₁₈₆H₁₁₅J₂₄₄K₁₅₆L₂₁₀M₂₀₈
14	Alpetra	A₁₄₅B₁₄₆C₁₆₀D₁₈₆H₁₂₀J₂₄₄K₁₆₅L₂₁₀M₂₀₈
15	Zolotnitsa	A₁₃₇B₁₅₄C₁₆₀D₂₁₂H₁₁₅J₂₄₄K₁₅₆L₂₁₀M₁₇₀
16	Apis	A₁₂₅B₁₅₄C₁₆₀D₂₁₂H₁₁₅J₂₄₄K₁₅₆L₂₁₀M₂₀₈
17	Luchistaya	A₁₂₅B₁₄₆C₁₆₀D₂₁₂H₁₁₅J₂₄₄K₁₅₆L₂₁₀M₂₀₈
18	Tisei	A₁₂₅B₁₄₆C₁₆₀D₂₀₆H₁₁₅J₂₄₄K₁₈₀L₂₁₀M₂₀₈
19	Pepelina	A₁₃₇B₁₅₄C₁₆₀D₁₆₈H₁₁₅J₂₄₄K₁₅₆L₂₁₀M₂₀₈
20	Charodeika	A₁₅₄B₁₆₃C₁₆₀D₁₈₆H₁₁₅J₂₀₀K₁₆₅L₂₁₀M₂₀₈
21	Persona	A₁₂₅B₁₄₆C₁₆₀D₂₁₂H₁₀₅J₂₂₀K₁₃₅L₁₈₇M₁₇₅
22	Statnaya	A₁₂₅B₁₄₆C₁₆₅D₂₁₂H₁₀₅J₂₂₈K₁₃₅L₁₈₇M₁₇₀
23	Evgeniya	A₁₄₅B₁₅₄C₁₇₅D₂₁₂H₁₀₅J₂₂₈K₁₃₅L₁₈₇M₂₀₅
24	Zhuravushka	A₁₄₅B₁₅₄C₁₆₀D₂₂₀H₁₀₅J₂₂₀K₁₃₅L₁₈₇M₂₀₈
25	Bonus	A₁₃₇B₁₃₇C₁₇₅D₂₀₀H₁₀₅J₂₄₄K₁₅₆L₁₈₇M₁₉₅
26	Lebedushka	A₁₃₇B₁₄₆C₁₆₀D₁₂₀H₁₀₅J₂₂₀K₁₄₅L₁₈₇M₂₀₈
27	Kukhanna	A₁₃₇B₁₄₆C₁₈₅D₁₂₀H₁₀₅J₂₄₄K₁₃₅L₁₈₇M₂₀₈
28	MK 100	A₁₃₇B₁₄₆C₁₈₅D₂₀₆H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₁₈₇M₂₀₈
29	Nevesta	A₁₃₇B₁₄₆C₁₈₅D₁₈₆H₁₁₅J₂₄₄K₁₅₆L₁₈₇M₂₀₈
30	Nega 1	A₁₃₇B₁₄₆C₁₇₅D₁₆₈H₁₁₅J₂₄₄K₁₄₅L₁₈₇M₁₉₅
31	Oktyabr 70	A₁₄₅B₁₄₆C₁₈₅D₁₅₄H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₁₈₇M₂₀₈
32	Gratsiya	A₁₃₇B₁₄₆C₁₆₅D₁₄₈H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₁₈₇M₁₈₅
33	Intriga	A₁₃₇B₁₄₆C₁₈₅D₂₀₀H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₁₈₇M₁₉₅
34	Lastochka	A₁₄₅B₁₅₄C₁₈₅D₂₁₂H₁₀₅J₂₄₄K₁₅₆L₂₁₀M₁₈₅
35	Tatiana	A₁₃₇B₁₃₇C₁₆₀D₂₁₂H₁₀₅J₂₅₆K₁₅₆L₁₈₇M₂₀₈
36	Garmoniya	A₁₅₄B₁₄₆C₁₇₅D₂₁₂H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₁₈₇M₂₁₈
37	Sonata	A₁₅₄B₁₄₆C₁₇₅D₂₁₂H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₁₈₇M₂₀₈
38	Kitrossa	A₁₅₄B₁₄₆C₁₇₅D₁₇₆H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₁₈₇M₂₂₅
39	Alena	A₁₅₄B₁₃₇C₁₅₀D₁₆₈H₁₁₅J₂₀₀K₁₃₅L₁₈₇M₁₈₅
40	Dikaya soya 31	A₁₃₇B₁₅₄C₁₈₅D₁₂₀H₁₂₆J₂₂₈K₁₃₅L₁₈₇M₁₇₀
41	KZ‑6337	A₁₀₈B₁₄₆C₁₆₀D₁₈₆H₁₁₅J₂₀₀K₁₃₅L₁₄₈M₁₇₀
42	KBl‑29 ^[3]	A₁₄₅B₁₇₆C₁₇₅D₁₂₀H₁₂₆J₂₄₄K₁₆₅L₂₁₀M₂₀₈
43	KA‑14133	A₁₄₅B₁₇₆C₁₇₅D₁₂₀H₁₂₆J₂₄₄K₁₆₅L₂₁₀M₂₀₈
44	KA‑32	A₁₂₅B₁₇₆C₁₇₅D₁₂₀H₁₂₆J₂₄₄K₁₆₅L₂₁₀M₂₀₈
45	KBel‑72	A₁₄₅B₁₇₆C₁₆₀D₁₂₀H₁₂₆J₂₄₄K₁₆₅L₂₁₀M₂₀₈
46	KBl‑24³	A₁₄₅B₁₇₆C₁₇₅D₁₂₀H₁₂₆J₂₄₄K₁₆₅L₂₁₀M₂₀₈
47	KA 346⁴	A₁₃₇B₁₇₆C₁₇₅D₁₃₈H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₂₁₀M₂₀₈
48	KT‑156 ^[4]	A₁₃₇B₁₇₆C₁₇₅D₁₃₈H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₂₁₀M₂₀₈
49	KZ‑578⁴	A₁₃₇B₁₇₆C₁₇₅D₁₃₈H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₂₁₀M₂₀₈
50	KBl‑90	A₁₂₅B₁₇₆C₁₇₅D₁₈₆H₁₁₅J₂₄₄K₁₃₅L₂₁₀M₂₀₈
51	KBl‑77	A₁₅₄B₁₇₆C₁₇₅D₁₃₈H₁₁₅J₂₄₄K₂₁₃₅L₂₁₀M₂₀₈

Note. *Lokus code A — Satt1, B — Satt2, C — Satt5, D — Satt9, H — Soyhsp176, J — Satt681, K — Sat_263, L — Satt141, M — Satt181.
Source: compiled by A.A. Ivaniy, A.A. Penzin, O.N. Bondarenko, P.D. Timkin based on experimental data.

Для упрощения визуальной идентификации сортов составлены молекулярные профили, которые приведены в виде электрофореграммы со всеми исследованными локусами для каждого сорта (рис. 1).

Рис. 1. Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК по сортам: 2–3 — Персона; 4–5 — Статная; 7–8 — Евгения; 9–10 — Журавушка; 12–13 — Бонус; 14–15 — Лебедушка;
17–18 — Куханна с использованием локуса Satt181
Fig. 1. Electrophoregram of DNA amplification products by cultivars: 2–3 — Persona; 4–5 — Statnaya; 7–8 — Evgeniya; 9–10 — Zhuravushka; 12–13 — Bonus; 14–15 — Lebedushka;
17–18 — Kukhanna using Satt181 locus
Source: compiled by A.A. Ivaniy, A.A. Blinova, A.E. Gretchenko based on experimental data.

Результаты полученной электрофореграммы показали, что каждая пара праймеров гибридизовалась со своей мишенью и эффекта off-target не наблюдалось, следовательно, используемые нами праймеры и температурные режимы способствуют высокой специфичности.

Для выяснения взаимосвязи между генотипами проведен кластерный анализ в виде циркулярной дендрограммы (рис. 2). Дендрограмма генетического родства демонстрирует наличие нескольких обособленных кластеров.

Анализ полученной дендрограммы позволил выделить 13 отдельных кластеров сои. Для генотипов исследуемых сортов культурной сои получены уникальные наборы аллелей, которые можно использовать для составления молекулярно-генетических формул и последующей паспортизации. Можно наблюдать, что формы дикой сои не являются родственными сортам культурной сои, следовательно, использования 9 пар праймеров достаточно для получения генетических паспортов сортов культурной и форм дикой сои с последующим выявлением их генетического родства. Тот факт, что дендрограмма на основе UPGMA сгруппировала 51 генотип сои в 13 обособленных кластеров, указывает на то, что большинство сортов имеют общих родителей. Кластеры XI, XIII состоят только из 1 генотипа, что свидетельствует об уникальности аллельных наборов у формы дикой сои КЗ‑6337 и Дикая соя 31 соответственно. Для форм дикой сои в кластерах IX (КБл‑29, КА‑1413, КБЛ‑24) и X (КА‑346, КТ‑156, КЗ‑578) не было обнаружено уникальных наборов аллелей из-за чего применение данной технологии в дифференциации форм дикой сои не представляется возможным, а молекулярно-генетические формулы не релевантны для использования в целях паспортизации с помощью данной маркерной системы и требуют дополнительных исследований.

Рис. 2. Дендрограмма 51 генотипа сои (39 сортов культурной и 12 форм дикой сои)
Источник: составлено А.А. Иваний на основе экспериментальных данных.

Fig. 2. Dendrogram for 51 soybean genotype (39 cultivars and 12 wild forms)
Source: compiled by A.A. Ivaniy based on experimental data.

Заключение

С использованием системы из 9 SSR-маркеров идентифицирован 51 генотип сои. Для каждого из культурных сортов получены уникальные наборы аллелей. Построена UPGMA-дендрограмма и выявлена степень генетического родства форм дикой и сортов культурной сои с целью их дальнейшей молекулярно-генетической паспортизации. На основе полученных уникальных генетических характеристик сортов культурной и сортообразцов дикой сои в дендрограмме произведена их группировка по 13 кластерам, характеризующимся родственным генотипом. Формы дикой сои преимущественно располагаются в отдельном кластере, что свидетельствует об адекватности выбранных локусов для популяционно-генетического анализа. Исключением стали две формы дикой сои — КЗ‑6337 и Дикая соя 31, которые находятся в отдельных кластерах, что может быть следствием отдаленного от остальных форм ареала или объясняться другими эволюционными причинами. При анализе полученной дендрограммы можно выделить форму дикой сои — Дикая соя 3, генетически отдаленную от остальных сортов дикой сои, но генетически близкую с сортами культурной сои, откуда следует, что маркерная система не подошла для дифференцирования форм дикой сои. Таким образом, использованный в исследовании набор 9 пар праймеров к микросателлитным маркерам Satt1, Satt2, Satt5, Satt9, Soyhsp176, Satt681, Sat_263, Satt141, Satt181 обладает достаточной информативностью и может быть рекомендован к применению с целью идентификации сортов культурной сои и составления генетических паспортов. Для форм дикой сои требуется использование дополнительного набора локусов или более точные аналитические методы, например секвенирование по Сенгеру, которое даст возможность оценить полиморфизм по нуклеотидному составу, а не по длине.

^{¹ Сорта, относящиеся к Х кластеру и имеющие сходные молекулярно-генетические формулы.}

^{² Сорта, относящиеся к IХ кластеру и имеющие сходные молекулярно-генетические формулы.}

^{³ Varieties belonging to the X cluster and having similar molecular genetic formulas.}

^{⁴ Varieties belonging to the IX cluster and having similar molecular genetic formulas.}