Иммунологические показатели при серозно-катаральном воспалении вымени у лактирующих коров

Полный текст

Введение

Мастит — основная причина снижения удоев, качественных показателей молока, сокращения молочной продукции и преждевременной выбраковки животных [1]. Частой причиной маститов являются микротравмы, к которым присоединяется воспаление. Воспаление осложняется патогенной и условно-­патогенной микрофлорой: Staphylococcus aureus, коагулазонегативные стафилококки (КНС), Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Mycoplasma bovis, Mycoplasma spp., Corynebacterium bovis [2, 3].

Интенсивное содержание молочного скота существенно влияет на иммунитет молочной железы и способность организма лактирующих коров противостоять маститу [4, 5], вследствие чего маститы переходят в хронические, что снижает общий иммунитет у коров.

Целью исследования является изучение иммунологических параметров крови у лактирующих коров при серозно-­катаральном воспалении вымени для выявления патогенетических механизмов заболевания.

Материалы и методы исследования

Исследования проводили осенью в одном из животноводческих хозяйств Амурской области. Объект исследования — лактирующие коровы голштинской породы на 2–4‑й месяц лактации. Группы коров формировали по 10 голов в каждой: контрольная (здоровые) и опытная (больные серозно-­катаральным маститом).

Диагностику маститов проводили по баллам, согласно клиническим критериям диагностики маститов Силивировой Т.Л., Федотову С.В. (2004). Критериями оценки состояния молочной железы являлись ее внешний вид, исследования секрета, пальпация, состояние надвыменных лимфатических узлов [6].

Дополнительно коров проверяли на мастит быстрым маститным тестом (БМТ) — Масттест. В состав Масттеста входит сульфанол (поверхностно-­активное вещество), который при взаимодействии с ДНК ядер соматических клеток молока образует сгусток различной плотности, а при изменении pH молока меняется цвет смеси. Реакцию учитывали по степени образования желеобразного сгустка и изменению цвета смеси [7].

Количество соматических клеток в молоке определяли визуальным методом по изменению вязкости смеси молока с препаратом Мастоприм согласно ГОСТ 23453–2014 ^[1].

Другие сопутствующие заболевания у коров, больных маститом, на момент исследования не были выявлены.

Кровь для исследований отбирали из хвостовой вены. Уровень неспецифической резистентности определяли: по общему белку на рефрактометре; фракции белка нефелометрическим методом [8]; лизоцимной активности сыворотки крови (ЛАСК) нефелометрическим методом по В.Г. Дорофейчуку (1968); фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН) по методике А.И. Иванова и Б.А. Чухловина (1967); циркулирующим иммунным комплексам (ЦИК) методом Ю.А. Гриневича и А.Н. Алферова (1981); количеству лейкоцитов, в т. ч. лимфоцитов [9].

Клинические и бактериологические исследования, определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам проводили согласно наставлениям, методическим указаниям и рекомендациям: «Методические рекомендации по микробиологическому исследованию молока и секрета вымени коров для диагностики мастита» ^[2]; «Методические указания по бактериологическому исследованию молока и секрета вымени коров» ^[3]; Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2. 1890–04 ^[4]; «Наставления по диагностике, терапии и профилактике мастита у коров» ^[5].

Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и пакета программ Microsoft Excel. Различия значений считали достоверными при p < 0,05.

Результаты исследования и обсуждение

У коров опытной группы клинически серозно-­катаральный мастит проявлялся поражением одной или двух четвертей вымени, их покраснением, отеком, болезненностью, повышением местной температуры. Первые порции молока были жидкие и содержали хлопья или крошковидные сгустки выпавшего казеина, затем, по мере выдаивания, выделялось нормальное молоко. По клиническим критериям диагностики по Т.Л. Силивировой, С.В. Федотову [6] маститы оценивали в 3–4 балла.

При бактериологическом исследовании из молока лактирующих коров, больных серозно-­катаральным маститом, выделили условно-­патогенные и патогенные микроорганизмы: Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae + Escherichia coli, Staphylococcus saprophyticus + Streptococcus agalactiae + Escherichia coli, Staphylococcus haemolyticus (рис.) [10].

Микробиологический профиль молока из пораженных долей вымени у лактирующих коров, %
Источник: выполнено М.Е. Остяковой, К.С. Косицыной, В.К. Ирхиной.
Microbiological profile of milk from affected udder lobes in lactating cows,%
Source: compiled by M.E. Ostyakova, K.S. Kositsyna, V.K. Irkhina.

Количество соматических клеток в молоке здоровых коров находилось в пределах до 500 тыс. кл/мл, а у больных клиническим маститом было выше допустимого уровня.

Уровень общего белка в сыворотке крови у коров с маститами был выше, чем у здоровых коров на 8,4 % (р < 0,05) (табл. 1).

Таблица 1
Биохимический анализ крови лактирующих коров при серозно-­катаральном мастите M ± m, n = 10

Показатель	Группы коров
	Контрольная	Опытная
Общий белок, г/л	79,5 ± 1,14	86,2 ± 2,13*
Альбумины,%	41,9 ± 0,58	21,0 ± 1,82***
a-глобулины,%	12,3 ± 0,77	13,2 ± 1,97
β-глобулины,%	17,6 ± 0,87	40,3 ± 3,06***
γ-глобулины,%	28,2 ± 1,21	25,6 ± 2,96

Примечание. * — р < 0,05; ***— р < 0,001, по отношению к контрольной группе.
Источник: выполнено М.Е. Остяковой, К.С. Косицыной, В.К. Ирхиной.

Table 1
Biochemical analysis of blood of lactating cows  in serous catarrhal mastitis M ± m, n = 10

Parameter	Cow groups
	Control	Experimental
Total protein, g/l	79.5 ± 1.14	86.2 ± 2.13*
Albumins,%	41.9 ± 0.58	21,0 ± 1.82***
a-globulins,%	12.3 ± 0.77	13.2 ± 1.97
β-globulins,%	17.6 ± 0.87	40.3 ± 3.06***
γ-globulins,%	28.2 ± 1.21	25.6 ± 2.96

Note. * — p < 0.05; ***— p < 0.001, in relation to the control group.
Source: compiled by M.E. Ostyakova, K.S. Kositsyna, V.K. Irkhina.

В группе лактирующих коров с маститами отмечали диспротеинемии, которые проявлялись низким уровнем альбуминов (на 50,1 % (р < 0,001)) и высоким уровнем бета-глобулинов (в 2,3 раза (р < 0,001)).

Гипербетаглобулинемия, вероятно, обусловлена повышением концентрации гемопексина и компонентами комплемента С3, С4, которые входят во фракцию бета-глобулинов. При воспалении восстанавливается и улучшается фагоцитарная активность при опосредованном гемопексином поглощении гема, применении агонистов PPARγ или IL‑4 путем функциональной и метаболической перестройки связи макрофагов [11].

Низкий уровень альбуминов был связан с повышением вязкости и концентрации крови, так как при воспалении изменяются реологические особенности крови: происходит усиление выпотевания альбуминов, в связи, с чем относительно увеличивается количество глобулинов и фибриногена [12].

Концентрация лейкоцитов в группе опыта была выше, чем у здоровых в 1,4 раза (р < 0,001) (табл. 2).

Таблица 2
Иммунологические показатели крови лактирующих коров  при серозно-­катаральном мастите M ± m, n = 10

Показатель	Группы животных
	Контрольная	Опытная
Эритроциты, 1012 л	5,7  ±  0,13	7,7 ± 0,21***
Лейкоциты, 109 л	6,5 ± 0,25	9,4 ± 0,44***
Гемоглобин, г/л	113,4 ± 3,13	127,0 ± 2,39**
Гематокрит, %	66,5 ± 1,75	88,9 ± 1,42***
Цветовой показатель	0,9 ± 0,03	1,1 ± 0,02
Эозинофилы, %	2,3 ± 0,54	1,9 ± 0,66
Палочкоядерные нейтрофилы, %	1,3 ± 0,15	3,1 ± 0,50**
Сегментоядерные нейтрофилы, %	31,5 ± 1,05	39,3 ± 4,01
Лимфоциты, %	63,7 ± 1,18	52,8 ± 4,50*
Моноциты, %	1,2 ± 0,39	2,9 ± 0,91
ФАН, %	88,3 ± 0,78	97,7 ± 1,46***
ЛАСК, %	15,3 ± 0,84	19,0 ± 1,51*
ЦИК, г/л	36,6 ± 1,36	90,5 ± 5,93***

Примечание. * — р < 0,05; ** — р < 0,01, *** — р < 0,001, по отношению к контрольной группе; базофилы, миелоциты и метамиелоциты не обнаружены.
Источник: выполнено М.Е. Остяковой, К.С. Косицыной, В.К. Ирхиной.

Table 2
Immunologic indicators of blood of lactating cows  in serous catarrhal mastitis M ± m, n = 10

Parameter	Cow groups
	Control	Experimental
Erythrocytes, 1012 l	5.7 ± 0.13	7.7 ± 0.21***
Leukocytes, 109 l	6.5 ± 0.25	9.4 ± 0.44***
Hemoglobin, g/l	113.4 ± 3.13	127.0 ± 2.39**
Hematocrit, %	66.5 ± 1.75	88.9 ± 1.42***
Color index	0.9 ± 0.03	1.1 ± 0.02
Eosinophils, %	2.3 ± 0.54	1.9 ± 0.66
Band neutrophils, %	1.3 ± 0.15	3.1 ± 0.50**
Segmented neutrophils, %	31.5 ± 1.05	39.3 ± 4.01
Lymphocytes, %	63.7 ± 1.18	52.8 ± 4.50*
Monocytes, %	1.2 ± 0.39	2.9 ± 0.91
FAN, %	88.3 ± 0.78	97.7 ± 1.46***
LASK, %	15.3 ± 0.84	19.0 ± 1.51*
CIC, g/l	36.6 ± 1.36	90.5 ± 5.93***

Note. * — p < 0.05; ** — p < 0.01, *** — p < 0.001, in relation to the control group; basophils, myelocytes and metamyelocytes were not detected.
Source: compiled by M.E. Ostyakova, K.S. Kositsyna, V.K. Irkhina.

У больных коров отмечали признаки гемоконцентрации: высокий уровень гематокрита (в 1,4 раза, р < 0,001), общего белка (на 8,4 %, р < 0,05), эритроцитов (в 1,4 раз, р < 0,001), гемоглобина (в 1,1 раз, р < 0,001) и цветового показателя (1,2 раза, р < 0,01).

Концентрация лимфоцитов в группах больных коров была ниже, чем у здоровых на 17,1 % (р < 0,05). Уровень палочкоядерных нейтрофилов выше в группе у маститных коров в 2,4 раза (р < 0,01). Нейтрофилы вырабатывают лизоцим, являющийся одним из факторов естественной резистентности, вызывающим лизис возбудителей бактериальных инфекций, в т. ч. с множественной лекарственной устойчивостью [13]. Уровень лизоцимной активности сыворотки крови у коров при маститах был выше, чем у здоровых в 1,2 раза (р < 0,05).

У маститных коров на 10,65 % выше, чем у здоровых, была фагоцитарная активность нейтрофилов (р < 0,001). У коров, больных маститом, оцененных на 3 балла, она составляла 100,0 %, что было выше на 4,9 %, чем в группе коров, оцененных на 4 балла (95,3 ± 2,61 %). Достоверность между группами коров отсутствовала.

Нейтрофилы — это мультипотентные клетки, выполняющие множество важных биологических функций в дополнение к фагоцитозу: выработка различных видов цитокинов / хемокинов / факторов роста, высвобождение нейтрофильных внеклеточных ловушек (NET) / эктосом / экзосом и трогоцитоз (обмен мембранами) с соседними клетками для модуляции врожденных и адаптивных иммунных реакций. Нейтрофилы также могут играть роль в ослаблении воспалительной реакции и заживлении ран с помощью подмножества нейтрофилов, полученных из миелоидных супрессорных клеток (PMN-MDSC) [14].

Иммунные комплексы (ИК) образуются во время иммунного ответа и могут отражать некоторые аспекты текущего иммунного ответа. Уровень ЦИК у больных животных был выше, чем у здоровых в 2,5 (р < 0,001), что объясняется наличием у коров инфекционно-­воспалительного процесса [11, 12] в молочной железе. У коров с маститом, оцененных на 3 балла, уровень ЦИК (105,2 ± 3,51 г/л) был выше на 34,5 % (р < 0,05), чем в группе коров, оцененных на 4 балла (75,8 ± 6,17 г/л). Повышенный уровень ЦИК коррелировал с тяжестью воспаления, что обусловлено ингибированием опосредованной лимфоцитами цитотоксичности, вызванной антителами [15].

ИК, образованные чужеродными или собственными антигенами и антителами в биологических жидкостях, воздействуют на различные ткани и вызывают ряд заболеваний, а также являются триггерами возникновения иммунологических нарушений [16]. Нейтрофилы могут взаимодействовать с тромбоцитами, эпителиальными и эндотелиальными клетками, обеспечивая гемостаз, воспаление слизистых оболочек и атерогенез [19]. Поэтому лечение маститов у коров должно быть комплексным, включая антибактериальную и противовоспалительную терапию.

Заключение

Воспалительный процесс в молочной железе лактирующих коров обусловливался повреждением тканей и осложнялся условно-­патогенной микрофлорой. У больных животных отмечали нарушения белкового обмена (гипоальбуминемию, диспротеинемии) и признаки гемоконцентрации (повышенные гематокрит и гемоглобин, эритроцитоз). Условно-­патогенная микрофлора и продукты воспаления в молочной железе стимулировали клеточный и гуморальный иммунитет. Высокий уровень фагоцитарной активности и циркулирующих иммунных комплексов у больных маститом коров явились результатом иммунного ответа при антигенной стимуляции.

 

 

_{¹ ГОСТ 23453–2014. Молоко сырое. Методы определения соматических клеток. М. : Стандартинформ, 2015.}

_{² Методические рекомендации по микробиологическому исследованию молока и секрета вымени коров для диагностики мастита / В.М. Карташова, Л.А. Таранова. М . : Россельхоакадемия, 1994. 35 с.}

_{³ Методические указания по бактериологическому исследованию молока и секрета вымени коров. Утв. Главным управлением ветеринарии МСХ СССР, 1983. 14 с.}

_{⁴ Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2. 1890–04. М. : Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. 91 с.}

_{⁵ Наставление по диагностике, терапии и профилактике мастита у коров. Департамент ветеринарии. 30.03.2000 г. № 13–5–2/1948.}

Об авторах

Марина Евгеньевна Остякова

Дальневосточный зональный научно-исследовательский ветеринарный институт

Email: dalznividv@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2996-0991
SPIN-код: 3038-0685

доктор биологических наук, доцент, директор

Российская Федерация, 675005, Амурская обл., г. Благовещенск, ул. Северная, д. 112

Ксения Сергеевна Косицына

Дальневосточный зональный научно-исследовательский ветеринарный институт; Дальневосточный государственный аграрный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: kseniya-kos1997@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0005-6247-0280
SPIN-код: 9056-4692

младший научный сотрудник отдела микробиологии, вирусологии и иммунологии, Дальневосточный зональный научно-исследовательский ветеринарный институт; ассистент кафедры ветеринарносанитарной экспертизы, эпизоотологии и микробиологии, Дальневосточный государственный аграрный университет

Российская Федерация, 675005, Амурская обл., г. Благовещенск, ул. Северная, д. 112; Российская Федерация, 675005, Амурская область, г. Благовещенск, ул. Политехническая, д. 86

Вера Константиновна Ирхина

Дальневосточный зональный научно-исследовательский ветеринарный институт

Email: dalznividv@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4553-7189
SPIN-код: 7893-0109

научный сотрудник отдела животноводства и птицеводства

Российская Федерация, 675005, Амурская обл., г. Благовещенск, ул. Северная, д. 112

Список литературы

Дополнительные файлы