Общие закономерности динамики развития биопленок грибов Aspergillus spp.

Полный текст

Введение

При статистически достоверной тенденции возрастания инцидентности социально значимых микозов, опосредованных избыточным ростом адвентивной споруляцией в тканях, установлено доминирование этиологической значимости грибов Aspergillus spp. [1–3]. Длительность микологических исследований при дифференциации хронических фтизиатрических процессов достигает от 46 до 110 суток, что сопряжено с применением антимикотической терапии [4–6]. Азолрезистентные штаммы причислены к первой категории критического уровня приоритетности для исследований в соответствии с перечнем патогенов «WHO Fungal Priority Pathogens List» ^[1] [7, 8]. Территориальные ранжирования репрезентативной выборки позволяют прогнозировать дальнейшее увеличение резистентности к лекарственным и дезинфицирующим препаратам изолятов, идентифицированных из патматериала млекопитающих, птиц, рептилий, земноводных, рыб и пчел [9–15]. Контаминация пищевой продукции и кормов метаболитами грибов в концентрациях, опасных для здоровья человека и животных, может достигать от 40,0 до 100,0 % [16–19]. При развитии локальной и системной инфекции человека и животных, фитопатологии, а также деградации природных и синтетических полимеров, жилых и производственных конструкций морфогенез микромицет инициируется репрезентацией сигнальных молекул Quorum Sensing (QS) [20–23]. Для оптимизации длительной и ретроспективной схемы микологических исследований, разработке эффективных препаратов, снижающих адгезивные свойства микроорганизмов, блокирующих синтез или разрушающих полимерный матрикс, актуальность и научную новизну представляют исследования механизмов инициации, развития, формирования и дисперсии биопленок.

Цель исследования — анализ динамики изменений морфофункциональных показателей при инициации, развитии и дисперсии грибов Aspergillus spp.

Материалы и методы исследования

Штаммы. В опытах исследовали референтные штаммы (АТСС): Aspergillus flavus 16883, Aspergillus fumigatus 1028, Aspergillus niger 16404 ^[2].

Питательные среды. Для культивирования микроорганизмов использовали среды: МПБ, МПА, кукурузный агар; агар Чапека с дрожжевым экстрактом (Оболенск, ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», Россия); шоколадный агар (BioMedia, Россия); Sabouraud Fluid Medium и Sabouraud Dextrose Agar w/Chloramphenicol & Cycloheximide (Condalab, Испания).

Микроорганизмы культивировали при 35 ± 2,0 °C в течение 168 ± 1 ч, исследование фенотипических признаков проводили общепринятыми микологическими методами. Для морфометрических исследований образцы фиксировали 30,0%-м раствором NaOH в течение 30 мин; окрашивали водным раствором генцианвиолета 1 : 2000 и по Граму (BioVitrum, Россия). Препараты «раздавленная капля» готовили из мицелия грибов слегка прикоснувшись к поверхности колонии микроорганизмов. Тщательное разделение гиф мицелия проводили препаровальными иглами, затем наносили каплю глицерина и покрывали покровным стеклом ^[3]. Для сохранения естественной архитектоники биопленок препараты фиксировали: в парах 25,0%‑го раствора глутарового альдегида в течение 8 ч; 1,0%‑м водным раствором осмиевой кислоты в течение 4 ч. Уплотнение исследуемых образцов проводили этанолом возрастающей концентрации 30, 50, 96, 100° [24]. Оптическую плотность образцов оценивали с применением фотометрического анализатора Immunochem‑2100 (HTI, USA), (OD₅₈₀). Морфометрические показатели учитывали с применением оптического микроскопа Trinocular Unico (Unico, США).

Результаты исследований обрабатывали методом статистического анализа с использованием критерия Стьюдента, результаты считали достоверными при р ≤ 0,05.

Результаты исследования и обсуждение

При 35 ± 2,0 °C культивирования в жидких и плотных средах в течение 168 ± 1 ч изученные микроорганизмы A. flavus, A. fumigatus, A. niger имели характерный рост, вполне информативный. Культуры микроорганизмов — быстрорастущие: наличие роста микромицет наблюдали на поверхности жидких сред в пробирках и периферической части чашек Петри. Это связано с аэробными свойствами грибов. В зависимости от состава питательных сред и времени культивирования, микромицеты различались как по объему воздушного мицелия — от крайне слабого до обильного, так и окрашиванию обратной стороны колоний (реверс): от почти полного видимого наличия до розовато-коричневых интенсивно окрашенных тонов. Центральная часть колонии очень плотная, интенсивнее окрашена, периферическая часть истонченная, выявлялся бледного цвета пигмент, диффундирующий в толщу среды (рис. 1).

Рис. 1. Культуры микроорганизмов A. flavus (35 ± 2,0) °C, 48 ± 1 ч: a — среда Сабуро; b — шоколадный агар
Источник: выполнили Е.М. Ленченко, Н.П. Сачивкина, Д.А. Банникова.

Культуры микроорганизмов A. fumigatus были дымчатые, серовато-зеленые, реверс светло-желтого цвета. Фактура колоний от шерстистых до ватообразных с некоторой зернистостью. На апикальных полюсах тончайших нитевидных структур выявлялись округлые образования зерновидной формы, светло-серого или интенсивно коричневого цвета. Культуры микроорганизмов A. flavus формировали шерстистые зеленые или белые пушистые ватообразные колонии, диффундирующие вглубь среды (2,0…3,0 мм). Изначально светло-зеленый, желто-зеленый или лимонный, по мере спороношения становится темно-зеленым, темно-желто-зеленым или буро-зеленым в центре. Реверс колоний бело-кремового цвета. Склероции из плотно переплетенных гифов мицелия — белые, по мере увеличения времени культивирования кремового цвета, а через 168 ч — коричневые. Как правило, выявлялся экссудат, капли которого, вначале бесцветные, постепенно приобретали светло-коричневый цвет. Дифференциальные признаки колоний: темно-зеленый центр и радиальные борозды; периферия — истонченные ажурной формы. Культуры микроорганизмов A. niger формировали вначале пушистые колонии, затем зернистые, реверс колоний бесцветный или желтоватого цвета. По мере спороношения цвет мицелия варьировал от темно-коричневого до черного цвета.

При 35 ± 2 °C в течение 168 ± 1 ч в статических условиях культивирования в зависимости от стадии клеточного цикла выявляли общие закономерности развития биопленок изученных грибов. Динамика развития гетерогенной популяции была опосредована адгезией, синтезом экоцеллюлярных молекул, пролиферацией, коагрегацией, дифференциацией структур мицелия в зависимости от стадии клеточного цикла. Реализация процессов межклеточной коммуникации инициировалась адгезией конидий к поверхности субстрата, в наших исследованиях — стекла. За счет апикального роста герментативных трубочек дифференцировались нитевидные структуры — гифы. По мере увеличения времени культивирования выявлялись участки значительной консоллидации гифов, дифференцировались конидиогенные структуры. Гифы изученных видов грибов были септированные, бесцветные.

Конидиеносцы A. flavus — грубошероховатые, бесцветные, длина 400,0–800,0 ± 0,8 мкм; везикулы округлой формы, 20,0–45,0 ± 0,7 мкм, поверхность которых почти полностью покрывали фиалиды, 8,0–12,0 ± 0,6, расположенные на метулах. Конидии — гладкие, округлой формы, d = 3,0–6,0 ± 0,5 мкм.

Конидиеносцы A. fumigatus — гладкие, бесцветные, длина 100,0–300,0 ± 0,4 мкм; везикулы куполовидные, 20,0–30,0 ± 0,3 мкм с плотно расположенными фиалидами, 5,0–10,0 ± 0,6. Конидии — гладкие или мелкошероховатые, округлые, d = 2,0–3,5 ± 0,8 мкм.

Конидиеносцы A. niger — гладкие, бесцветные, около везикулы темные, длина 300,0–400,0 ± 0,2 мкм. Везикулы сферической формы, 30,0–75,0 ± 0,5 мкм, поверхность покрывали фиалиды, 8,0–12,0 ± 0,6, расположенные на метулах. Конидии — шероховатые, округлой формы, d = 4,0–5,0 ± 0,5 мкм (рис. 2).

Рис. 2. Морфология микроорганизмов A. niger, культивирование на МПА при 35 ± 2 °C, в течение 168 ± 1 ч. Фиксация 30,0 % раствор NaOH, в течение 30 мин: ок. ×10, об. ×40, H604 Trinocular Unico, США
Источник: выполнили Е.М. Ленченко, Н.П. Сачивкина, Д.А. Банникова.

Популяционная иммобилизация биопленок — генетически и фенотипически детерминированная форма межклеточной коммуникации, Quоrum sensing, опосредованные особенностями цикличности роста и адаптацией популяции к действию экологических и антропогенных факторов [5, 25, 26]. При разработке новых и ротации лекарственных и дезинфицирующих средств перспективными признаны антиадгезивные композиционные препараты широкого спектра действия [11, 24, 27, 28]. Адаптивный потенциал гетерогенной многоклеточной популяции ингибируется QS молекулами, блокирующими синтез индукторов межклеточной коммуникации, что позволяет снизить адгезию, соответственно, степень контаминации микроорганизмов [24, 29, 30].

Заключение

Проведенное исследование раскрыло фундаментальные аспекты формирования и развития биопленок у представителей рода Aspergillus при оптимальных температурных условиях 35 ± 2 °C в течение 168 ± 1 часа. В ходе эксперимента была выявлена способность грибов к самоорганизации, проявляющаяся в формировании пространственно упорядоченных многоклеточных структур. Каждый этап развития биопленки — от первичной адгезии до финальной дисперсии — демонстрирует поразительную согласованность и адаптивность популяции. Особого внимания заслуживает сложная динамика популяционной иммобилизации, включающая последовательную смену фаз: пролиферацию, коагрегацию, филаментацию и другие ключевые процессы, тесно взаимосвязанные между собой.

Полученные результаты открывают новые горизонты в понимании механизмов жизнедеятельности микромицет и могут быть использованы в нескольких перспективных направлениях: совершенствование методологии длительных микологических исследований; разработка инновационных стратегий борьбы с устойчивыми биопленками; оптимизация биотехнологических процессов с использованием грибов; развитие методов биоремедиации.

Исследование механизмов формирования и функционирования грибковых биопленок представляет собой значительный вклад в современную микологию. Понимание этих процессов не только расширяет фундаментальные знания о жизнедеятельности грибов, но и открывает практические перспективы для решения актуальных проблем медицины, ветеринарии и биотехнологии.

 

^{1 WHO fungal priority pathogens list to guide research, development and public health action. Geneva : World Health Organization; 2022. Режим доступа: https://www.who.int/publications/i/item/9789240060241 (дата обращения: 20.01.2026).}

^{2 ATCC. The Global Bioresource Center. Режим доступа: https://www.lgcstandards-atcc.org (дата обращения: 05.05.2023).}

^{3 Саттон Д., Фотергилл А., Ринальди М. Определитель патогенных и условно патогенных грибов. М. : Мир, 2001.}

Об авторах

Екатерина Михайловна Ленченко

Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии - филиал ФНЦ ВИЭВ РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: lenchenko.ekaterina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2576-2020
SPIN-код: 9417-0889

доктор ветеринарных наук, профессор, научный консультант лаборатории санитарной микробиологии и сектора приготовления питательных сред

Российская Федерация, 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, д. 5

Надежда Павловна Сачивкина

Российский университет дружбы народов

Email: sachivkina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1100-929X
SPIN-код: 1172-3163

кандидат биологических наук, доцент департамента ветеринарной медицины

Российская Федерация, 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8, корп. 2

Дарья Андреевна Банникова

Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии - филиал ФНЦ ВИЭВ РАН

Email: andreevna.07@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4766-0183
SPIN-код: 1618-0317

кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник лаборатории санитарной микробиологии и сектора приготовления питательных сред

Российская Федерация, 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, д. 5

Марина Ивановна Шопинская

Российский университет дружбы народов

Email: shopinskaya-mi@rudn.ru
ORCID iD: 0000-0002-3823-3737
SPIN-код: 2550-4781

кандидат ветеринарных наук, доцент департамента ветеринарной медицины

Российская Федерация, 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8, корп. 2

Список литературы

Дополнительные файлы