Identification of genes for resistance to leaf and stem rust in breeding lines of spring common wheat from the secondary gene pool of Arsenal collection

Full Text

Введение

Листовая или бурая ржавчина (Puccinia triticina Eriks.) и стеблевая или черная ржавчина (Puccinia graminis f. sp. tritici) — это регулярно встречающиеся и опасные заболевания пшеницы как в России, так и за рубежом. В рамках программ по улучшению качества пшеницы по всей стране проводят испытания передовых селекционных линий и сортов пшеницы на устойчивость к распространенным видам ржавчины.

Для замедления эволюции патогенов, поражающих зерновые культуры, и предотвращения появления новых, более опасных рас, необходимо использовать стратегии, направленные на повышение генетической устойчивости агроценоза. К ним относятся частая смена сортов и выращивание сортов с разным уровнем устойчивости к болезням на одной территории (стратегия мозаичного размещения сортов). В передовых странах сорта создают за 3–4 года, тогда как в России этот срок значительно больше — 7…10 лет и более [1]. Селекция, направленная на создание сортов яровой пшеницы, имеющих разнообразную генетическую основу по устойчивости к листостебельным болезням, весьма актуальна.

Известно более 80 генов устойчивости к листовой и стеблевой ржавчине с установленной локализацией на хромосомах пшеницы [2]. Западно-­Сибирские популяции бурой и стеблевой ржавчины отличаются особой вирулентностью и могут преодолевать гены устойчивости растения, которые в других регионах являются эффективными. Установлены высокоэффективные к Puccinia triticina гены ювенильной устойчивости (Lr24, Lr28, Lr41, Lr45, Lr47, LrAg, LrAeg.speltoides) и возрастной устойчивости (Lr35, Lr48, Lr49) [3]. В условиях южной лесостепи Западной Сибири иммунитет к стеблевой ржавчине проявили линии яровой пшеницы с генами: Sr9e, Sr24, Sr25, Sr26, Sr27, Sr31, Sr33, Sr35, Sr36, Sr38, SRDP‑2 c пирамидой генов Sr7a+Sr12+Sr [4]. По результатам собственных оценок коллекции почти изогенных линий с генами Lr и Sr в 2022 г. высокую эффективность проявили гены Lr9, Lr19, Lr24, Lr25, Lr26, Lr28, Lr29, Lr35, Lr37, Lr44, Lr45, Lr47 и Sr24, Sr31, Sr36.

Цель исследования состояла в идентификации некоторых известных эффективных и частично эффективных генов устойчивости к бурой (Lr19, Lr24, Lr26, Lr29, Lr34, Lr37) и стеблевой (Sr17, Sr22, Sr36, Sr39, Sr47) ржавчине у линий яровой мягкой пшеницы вторичного генофонда коллекции «Арсенал» современными методами диагностики. Полученные результаты послужат основой при разработке комплекса мероприятий, направленных на создание новых сортов яровой пшеницы с устойчивостью к листовой и стеблевой ржавчине в условиях Приобской лесостепи Алтайского края с использованием метода MAS.

Материалы и методы исследования

Исследования проводились в 2024–2025 гг. на базе молекулярно-­генетической лаборатории ФГБНУ «Федеральный Алтайский научный центр агробиотехнологий». Для идентификации Lr и Sr генов были взяты 25 линий яровой мягкой пшеницы из вторичного генофонда коллекции «Арсенал», созданные в ФИЦ «Немчиновка» путем многоступенчатой гибридизации доноров устойчивости к расе Ug99 стеблевой ржавчины. Эти селекционные линии обладают групповой устойчивостью к европейской и западно-­сибирской популяциям листовой и стеблевой ржавчины [5], которая была подтверждена полевыми исследованиями на опытном поле ФГБНУ «ФАНЦА» в 2021–2022 гг. Для оценки реакции и степени поражения видами ржавчины использовали шкалу CIMMYT [6].

ДНК пшеницы выделяли из 6–7‑дневных этиолированных проростков по методу Плашке с соавт. [7]. Идентификацию генов проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами, маркирующими Lr-гены: Lr19, Lr24, Lr26, Lr29, Lr34, Lr37 и Sr-гены: Sr17, Sr22, Sr36, Sr39, Sr47. Подбор праймеров осуществляли на основании литературных данных, их нуклеотидные последовательности показаны в табл. 1.

Таблица 1
ПЦР-маркеры, использованные для идентификации Lr и Sr-генов

Ген	Маркеры			Литературный источник
	Название	Нуклеотидная последовательность (5′-3′)	Размер ампликона п. н.
Lr19	SCS265-FSCS265-R	GGCGGATAAGCAGAGCAGAGGGCGGATAAGTGGGTTATGG	512	[8]
Lr24	SCS73-FSCS73-R	TCGTCCAGATCAGAATGTGCTCGTCGATTAGCAGTGAG	719	[9]
Lr26	SCM9-FSCM9-R	TGACAACCCCCTTTCCCTCGTTCATCGACGCTAAGGAGGACCC	207	[10]
Lr29	Lr29F24Lr29R24	GTGACCTCAGGCAATGCACACAGTGTGACCTCAGAACCGATGTCCATC	900	[11]
Lr34	csLV34-FcsLV34-R	GTTGGTTAAGACTGGTGATGGTGCTTGCTATTGCTGAATAGT	150	[12]
Lr37	VentriupLN2	AGGGGCTACTGACCAAGGCTTGCAGCTACAGCAGTATGTACACAAAA	259	[13]
Sr17	WPT5343-FWPT5343-R	TATTCTACAACGCTCCATCCCGCATGCAANCCATACCTTT	407	[14]
Sr22	WMC633-FWMC633-R	ACACCAGCGGGGATATTTGTTACGTGCACAAGACATGAGGTGGATT	117	[15]
Sr36	XSTM773-2FXSTM773-2R	ATGGTTTGTTGTGTTGTGTGTAGGAAACGCCCCAACCACCTCTCTC	155	[16]
Sr39	SR39#22-FSR39#22-R	AGAGAAGATAAGCAGTAAACATGTGCTGTCATGAGAGGAACTCTG	487	[17]
	Sr39#50s-­FSr39#50s-­R	CCAATGAGGAGATCAAAACAACCCTAGCAAGGACCAAGCAATCTTG	167
Sr47	WGWM501-FWGWM501-R	GGCTATCTCTGGCGCTAAAATCCACAAACAAGTAGCGCC	109	[18]

Источник: выполнено В.А. Петиным.

Результаты и обсуждение

По результатам наших оценок селекционных линий вся коллекция обладала высокой устойчивостью к бурой и стеблевой ржавчинам в условиях Приобской лесостепи Алтайского края в 2021 и 2022 гг. в сравнении со стандартным сортом Алтайская 70, который поражался бурой ржавчиной на 60…70 %, а стеблевой на 40 % (табл. 2). Исходя из этого, сделано заключение о наличии у них эффективных генов устойчивости Lr и Sr или их сочетаний.

Таблица 2
Результаты оценки устойчивости линий из коллекции «Арсенал» к листовой и стеблевой ржавчине, опытное поле ФГБНУ «ФАНЦА», 2021–2022 гг.

Сорт/линия	Родословная*	Оценка устойчивости к листовой ржавчине, %/тип		Оценка устойчивости к стеблевой ржавчине, %/тип
		2021	2022	2021	2022
Алтайская‑70 (восприимчивый контроль)	Алтайская‑98/ Алтайская‑325	70S	60S	40S	40S
1–16i	(96/113)/145//113	10MR	5MR	5MR	5MR
5–16i	(96/113)/145	5MR	R	5MR	5MR
6–16i	(96/113)/145	R	R	0	0
14–16i	96/113	R	R	R	R
17–16i	96/113	R	R	0	0
19–16i	96/113	0	0	R	R
20–16i	96/113	R	R	R	0
21–16i	96/113	0	R	0	R
25–16i	96/113	0	R	R	R
28–16i	(113/96)/145//113	R	R	R	0
30–16i	(113/96)/113	R	R	0	0
31–16i	(113/96)/113	R	R	R	R
34–16i	(113/96)/113	5MR	5MR	0	0
36–16i	(113/96)/145	R	R	R	R
37–16i	(113/96)/145	R	5MR	R	0
40–16i	(113/96)/145	R	R	5MR	5MR
44–16i	(113/119)/113	0	0	0	0
45–16i	(113/119)/113	0	0	R	0
48–16i	(113/119)/113	0	R	0	0
49–16i	(113/119)/113	R	5MR	5MR	5MR
53–16i	(113/119)/113	5MR	R	5MR	5MR
57–16i	(113/119)/119	R	R	0	0
60–16i	(119/113)/113/113	0	R	5MR	5MR
61–16i	(119/96)/113	R	R	0	0
135/10i	102/00i /Эстивум 440	R	R	0	0

Примечание. *В создании линий участвовали следующие доноры устойчивости к бурой и стеблевой ржавчине: линия озимой пшеницы GT 96/90 (Болгария) с генетическим материалом T. migushovae (в табл. указана как линия 96); линия 113/00i‑4 образец яровой пшеницы коллекции «Арсенал» с генетическим материалом видов Ae. triuncialis и T. kiharae (в табл. линия 113); линия яровой пшеницы 145/05i — результат скрещивания ярового сорта Лада с образцом коллекции «Арсенал» к‑62903, который получен с участием вида Ae. speltoides (в табл. линия 145); линия озимой пшеницы 119/4–06rw — трехродовой пшенично-­эгилопсно-ржаной гибрид, содержит чужеродный материал Ae. speltoides и S. cereale (в табл. линия 119); линия яровой пшеницы 135/10i — результат скрещивания образца коллекции «Арсенал» 102/00i (с генетическим материалом Ae. speltoides) с сортом яровой пшеницы Эстивум 440 [Чайка(оз)/Целинная 20/3/Юбилейная Осетии(оз)//Безостая 1/Саратовская 36].
Источник: выполнено В.А. Петиным.

В селекции пшеницы для повышения устойчивости к патогенам широко используется генетическое разнообразие диких и культурных сородичей, а также других злаковых культур. Транслокация 1RS/1BL, несущая гены Lr26, Sr31, Yr9 и Pm8, обеспечивающие устойчивость к мучнистой росе и ржавчинным болезням, является одним из наиболее часто применяемых генетических элементов селекционных программ в мире [19]. И хотя существует негативное влияние локуса Sec‑1, кодирующего ε-secalin (секалины — запасные белки зерна ржи), на хлебопекарные качества пшеницы, транслокация 1RS/1BL в целом оказывает положительное воздействие на урожайность и адаптивность к условиям внешней среды [20].

Идентификацию гена Lr26 проводили с использованием маркера SCM9, который позволяет дифференцировать генотипы, несущие 1BL.1RS и 1AL.1RS-транслокации. Ампликон размером 207 п. н. указывает на наличие 1ВL.1RS-транслокации, а 228 п. н. — на 1AL.1RS-транслокацию [21]. В результате проведения ПЦР фрагмент амплификации размером только 207 п. н. выявлен у 16 линий: 5–16i, 53–16i, 6–16i, 14–16i, 17–16i, 19–16i, 20–16i, 21–16i, 25–16i, 30–16i, 31–16i, 36–16i, 37–16i, 44–16i, 45–16i, 48–16i. Мягкая пшеница получила транслокацию 1RS от сорта ржи Petkus, которая располагается в длинном плече хромосомы 1В. В этой транслокации также находятся гены устойчивости к мучнистой росе Pm8, стеблевой (Sr31) и желтой (Yr9) ржавчине [2]. Гены устойчивости к трем видам ржавчины являются независимыми, но тесно сцеплены друг с другом. Транслокация 1BL.1RS, помимо прочего, содержит гены, благоприятно влияющие на урожайность, качество зерна и устойчивость к засухе, которая достигается благодаря повышению массы корней [20].

Ген Lr34 обеспечивает устойчивость растений пшеницы по типу медленного развития (slow rusting), который характеризуется удлиненным периодом формирования болезни после поражения, а также уменьшением количества пустул возбудителя на поверхности листа и их размеров. Использование этого гена в сочетании с другими генами устойчивости к бурой ржавчине (Lr10, Lr13, Lr16 и др.) позволит получить менее восприимчивые к болезни образцы и сорта пшеницы [22].

Ген устойчивости к бурой ржавчине Lr34 считается слабо эффективным в России [23], но представляет ценность в качестве источника сцепленных с ним в одном сегменте хромосомы других генов устойчивости к болезням, таких как желтая ржавчина (Yr18), мучнистая роса (Pm46) и стеблевая ржавчина (Sr57) [5].

Идентификацию гена Lr34 осуществляли с кодоминантным STS-маркером csLV34, маркирующим ген в различных аллельных состояниях. На доминантный (функциональный) аллель указывает наличие в образцах фрагмента амплификации с молекулярным весом 150 п. н., на рецессивный (не функциональный) аллель — 229 п. н. Обнаружение обоих аллельных вариантов гена Lr34 в образце может указывать на гетерозиготность по данному локусу, или это может быть следствием неоднородности исходного материала, обусловленной экстракцией ДНК из нескольких проростков с различным генотипом.

Почти все представленные линии обладали рецессивным аллелем гена Lr34. Доминантный аллель был выявлен только у линий 34–16i, 40–16i, и 135/10, а гетерозиготное аллельное состояние наблюдалось только у контрольного образца.

Ген Lr37 передан в мягкую пшеницу с транслокацией 2NS‑2AS от Aegilops ventricosa в составе кластера генов Yr17/Lr37/Sr38 и локализован в коротком плече хромосомы 2А. До недавнего времени он принадлежал к группе высокоэффективных во многих странах. Однако широкое возделывание сортов с геном Lr37 в Западной Европе привело к утрате его эффективности. В России эффективность гена Lr37 варьирует по регионам от высокой до умеренной [24].

Идентификацию гена Lr37 в коллекционных линиях проводили с праймерами VENTRIUP и LN2. Маркерный фрагмент размером 259 п. н. был выявлен у 11 генотипов: 5–16i, 34–16i, 53–16i, 60–16i, 17–16i, 30–16i, 31–16i, 44–16i, 45–16i, 48–16i, 57–16i.

Гены Lr19, Lr24 и Lr29 интрогрессированы в пшеницу от Agropyrum elongatum. Все они находятся в D геноме и тесно сцеплены с генами устойчивости к стеблевой ржавчине Lr19/Sr25 и Lr24/Sr24. Данные гены считаются высокоэффективными и широко используются в селекции.

Для идентификации этих генов использовали SCAR-маркеры SCS265 (Lr19), SCS73 (Lr24) и Lr29F24 (Lr29). Фрагменты амплификации по всем трем генам были обнаружены только у контрольных образцов, что говорит об отсутствии генетического материала Agropyrum elongatum в родословных исследуемых линий.

Ген Sr17 (от T. turgidum), лежащий в хромосоме 7B и сцепленный с Lr14a/Pm5, хоть и неэффективен к Ug99, но может обеспечить устойчивость к местным популяциям отдельных регионов и в сочетаниях с другими генами, например с Sr13 [25]. Ген Sr17 был обнаружен с использованием DArT-маркера wPt 5343 у 4 линий: 20–16i, 34–16i, 44–16i, 53–16i.

Ген Sr22 был первоначально идентифицирован у Triticum monococcum, затем был перенесен на тетраплоидную и гексаплоидную пшеницу путем межвидовой гибридизации. Данный ген эффективен против всех рас стеблевой ржавчины, и есть линии с Sr22, которые не сцеплены с нежелательными агрономическими признаками [26].

Ранее Sr22 был картирован на длинном плече хромосомы 7A. Три связанных маркера CFA2019, CFA2123 и BARC121 были использованы для гаплотипирования этого локуса [27]. Олсон и др. [15] создали новый набор линий с редуцированными чужеродными фрагментами и обнаружили, что ближайшими маркерами, примыкающими к Sr22 в этих линиях, являются WMC633 и CFA2123.

При использовании маркера CFA2123 характерный продукт в 234 п. н. мы наблюдали у всех исследуемых образцов, в т. ч. и у отрицательного контроля. Поскольку этот маркер не является полностью диагностическим и может давать ложноположительный результат, использовали еще один SSR маркер WMC633. В результате мы обнаружили амплифицированные продукты, описанные не только как диагностические. У всех линий были фрагменты порядка 240 п. н., а 117 п. н. отсутствовали только у 21–16i, 40–16i, 34–16i, 17–16i. Как писали Олсон и др. [15], это может быть связано с рекомбинацией между геном устойчивости и всеми маркерами, картированными в этом районе.

Sr36 интрогрессирован в пшеницу от T. timopheevii и локализован в коротком плече хромосомы 2B. Этот ген широко используется в селекции и распространен во многих сортах в мире. Sr36 эффективен к большинству рас стеблевой ржавчины, в т. ч. и к Ug99, кроме ее разновидностей TTKST и TTTSK [28]. Также его используют для создания пирамид в сочетаниях с другими генами Sr при селекции устойчивых сортов пшеницы.

Для определения этого гена использовали SSR кодоминантный маркер Xstm 773–2, который дал четкие, читаемые фрагменты длиной 155 п. н., свидетельствующие о наличии, и 190 п. н. — об отсутствии гена. У большинства образцов амплифицировался фрагмент в 155 п. н., а 190 п. н. обнаружен у 25–16i и 135/10i.

Ген устойчивости к стеблевой ржавчине Sr39 обеспечивает устойчивость ко всем известным патотипам Puccinia graminis f. sp. tritici, включая Ug99(TTKSK) и его варианты — TTKST и TTTSK, которые вирулентны против Sr24 и Sr36 — двух часто используемых генов устойчивости. Ген Sr39 был перенесен в гексаплоидный сорт пшеницы Marquis в хромосому 2B из 2S хромосомы Aegilops speltoides [29]. Перемещенный сегмент также содержит ген устойчивости к листовой ржавчине Lr35. Для идентификации Sr39 взяли маркеры Sr39#22r и Sr39#50s. По первому маркеру у всех образцов выявлен фрагмент в 820 п. н., что не соответствовало диагностическому фрагменту в 487 п. н. Аналогичная ситуация наблюдалась и по второму маркеру, при заявленном 167 п. н. фрагменте, у образцов амплифицировались продукты на 240 и 280 п. н. На данном этапе исследований можно предполагать отсутствие участка хромосомы с местом отжига этих праймеров. В дальнейшем, когда у нас появится контрольная линия с геном Sr39, повторный ПЦР анализ позволит уточнить это предположение.

Ген устойчивости к стеблевой ржавчине Sr47 перенесен из Aegilops speltoides путем гомеологичной рекомбинации с использованием ph1b-мутанта в твердую пшеницу, в результате чего получена линия DAS15. Мы провели исследование на присутствие гена Sr47, но без наличия контроля, как и в случае с Sr39. Ярко выраженный продукт размером 109 п. н. отметили у большей части образцов, исключения составили 14–16i, 19–16i, 25–16i, 31–16i, 44–16i, у которых он отсутствовал. Исследователи отмечают, что при использовании Xgwm501 насыщенный фрагмент длиной 109 п. н. указывает на присутствие хроматина Ae. speltoides, в то время как отсутствие фрагмента или меньшая его выраженность может говорить о сегменте хромосомы пшеницы [30].

В результате молекулярного скрининга у исследованных линий яровой мягкой пшеницы обнаружены как единичные Lr и Sr-гены, так и их пирамида (табл. 3). Наибольшее число идентифицированных генов было обнаружено у линии 53–16i (Lr26, Lr37, Sr17, Sr22, Sr36, Sr47), а у линий 1–16i, 28–16i, 49–16i, 61–16i исследуемых Lr-генов не обнаружено. С учетом высокой устойчивости последних генотипов в условиях Алтайского края и южной лесостепи Западной Сибири велика вероятность присутствия других эффективных генов устойчивости (например, Lr35, Sr32, Sr39, Sr40) или новых генов устойчивости, переданных от Ae. speltoides, T. kiharae или T. migushovae.

Таблица 3
Идентификация Lr и Sr-генов у линий яровой мягкой пшеницы из коллекции «Арсенал»

Сорт/линия	Lr-гены			Sr-гены
	Lr26	Lr34	Lr37	Sr17	Sr22	Sr36	Sr47
Алтайская‑70	-	-	-	-	-	-	-
1–16i	-	-	-	-	+	+	+
5–16i	+	-	+	-	+	+	+
6–16i	+	-	-	-	+	+	+
14–16i	+	-	-	-	+	+	-
17–16i	+	-	+	-	-	+	+
19–16i	+	-	-	-	+	+	-
20–16i	+	-	-	+	+	+	+
21–16i	+	-	-	-	-	+	+
25–16i	+	-	-	-	+	-	-
28–16i	-	-	-	-	+	+	+
30–16i	+	-	+	-	+	+	+
31–16i	+	-	+	-	+	+	-
34–16i	-	+	+	+	-	+	+
36–16i	+	-	-	-	+	+	+
37–16i	+	-	-	-	+	+	+
40–16i	-	+	-	-	-	+	+
44–16i	+	-	+	+	+	+	-
45–16i	+	-	+	-	+	+	+
48–16i	+	-	+	-	+	+	+
49–16i	-	-	-	-	+	+	+
53–16i	+	-	+	+	+	+	+
57–16i	-	-	+	-	+	+	+
60–16i	-	-	+	-	+	+	+
61–16i	-	-	-	-	+	+	+
135/10i	-	+	-	-	+	-	+

Источник: выполнено В.А. Петиным.

Заключение

Выявлено наличие широкого спектра генов устойчивости к листовой и стеблевой ржавчине у линий пшеницы из коллекции «Арсенал», что указывает на донорские свой­ства линий и возможность их эффективного использования в MAS для преодоления генетической однотипности местных сортов по устойчивости к ржавчинным болезням и решения проблемы фитосанитарной обстановки в крае.

About the authors

Vadim A. Petin

Altai Research Institute of Agriculture

Author for correspondence.
Email: 999.source.z@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6175-9510
SPIN-code: 7177-1334

младший научный сотрудник

Barnaul, Russian Federation

Sergey B. Lepekhov

Altai Research Institute of Agriculture

Email: sergei.lepehov@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1561-6345
SPIN-code: 9394-4835

кандидат сельскохозяйственных наук, ведущий научный сотрудник

Barnaul, Russian Federation

Inna F. Lapochkina

Nemchinovka Research Center

Email: lapochkina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2328-2798
SPIN-code: 9642-0889

доктор биологических наук, главный научный сотрудник

Moscow, Russian Federation

Nail R. Gainullin

Nemchinovka Research Center

Email: gainullin.nail@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0970-662X
SPIN-code: 4974-2310

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник

Moscow, Russian Federation

References

Supplementary files