Влияние распределения генотипов бета-казеина в двух поколениях на показатели молочной продуктивности крупного рогатого скота холмогорской породы

Полный текст

Введение

Производство высококачественной молочной продукции обусловливает необходимость проведения генотипирования крупного рогатого скота для повышения качественных и количественных показателей коровьего молока. В роли генетического маркера, влияющего на показатели молочной продуктивности, для селекционного отбора ремонтных телок и быков животных выступает ген бета-казеина.

Казеин составляет 78 % всех белков коровьего молока, из которых 35 % представляет бета-казеин. Он состоит из одной полипептидной цепи, включающей 209 аминокислот [1]. Бета-казеин кодируется геном CSN2, расположенным на 6‑й хромосоме крупного рогатого скота, и является высокополиморфным геном молочного белка, аллели А1 и А2 представляют наибольший интерес [2, 3]. Вариант А1 содержит аминокислоту гистидин в 67‑м положении, тогда как молоко A2 в аналогичном положении имеет аминокислоту пролин. Данное различие приводит к высвобождению опипоидного пептида бета-казоморфина‑7 в результате метаболических процессов в организме человека при употреблении молока А1. Бета-казоморфин‑7 может приводить к возникновению ишемической болезни сердца, диабета 1 типа, неврологическим расстройствам (аутизм, шизофрения), у детей он может быть причиной синдрома младенческой смерти [4].

Большинство исследователей показывают, что частота встречаемости аллельного варианта А1 чаще всего доминирует в стаде над аллелем А2 [3, 5, 6]. Соответственно, направленное производство молока от коров с генотипом А2А2 — более перспективное направление в молочном скотоводстве. Способом получения потомства с желательным генотипом является оценка и отбор ремонтных телок, а также закрепление быков-­производителей с генотипом А2А2 в стаде [7].

Наследование дочерним потомством генотипов по бета-казеину недостаточно изучено, требуется исследование не только коров и их дочернего потомства, но и быков-­производителей. Согласно законам наследственной передачи признаков Г. Менделя, на основе полученных данных генотипирования коров и быков-­производителей можно предполагать, с определенной долей вероятности, носителем какого генотипа будет являться их дочернее потомство.

Цель исследования — определить закономерности наследования желательного генотипа дочернего потомства от различных генотипов матерей и сопоставить эти закономерности с показателями молочной продуктивности.

Материалы и методы исследования

Исследование проведено в 2022—2023 гг. на двух поколениях крупного рогатого скота холмогорской породы (коров и их дочернего потомства) на базе ООО «Агрофирма ”Холмогорская“» и АО «Холмогорский племзавод». Для определения ассоциации генотипа и показателей молочной продуктивности отобрали 206 особей крупного рогатого скота холмогорской породы.

Произведен отбор цельной крови у крупного рогатого скота из яремной вены в вакуумные пробирки с К3 ЭДТА с целью экстракции ДНК для дальнейшего анализа. Выделение геномной ДНК проводили с помощью набора реагентов «МагноПрайм ВЕТ» (Россия, ООО «НекстБио») согласно протоколу.

Определение полиморфизма гена бета-казеина у коров проводили методом аллель специфичного ПЦР, использовали праймеры, синтезированные ЗАО «Евроген» (Россия), со следующей нуклеотидной последовательностью:

GBhF: 5’-СТТ-ССС-ТGG- GCC—CAT-CCA‑3’ (прямой праймер аллеля А1);

IGBhF: 5’-СТТ-ССС-ТGG-GCC—CAT-CCС‑3’ (прямой праймер аллеля А2);

IGBhR: 5’-AGA-СТG-GAG-CAG-AGG-CAG-AG‑3’ (обратный праймер аллелей А1, А2).

Для амплификации использовался амплификатор MiniAmp Plus, Республика Сингапур, Thermo Fisher Scientific.

Детектирование ДНК-продуктов амплификации осуществляли путем горизонтального электрофореза в 2 % агарозном геле. (табл. 1).

Таблица 1
Характеристика фрагментов ДНК аллельных вариантов CSN2

Генотипы CSN2	1 амплификат CSN2, п.н	2 амплификат CSN2, п.н
А1А1	А1—244	А2 — нет амплификата
А1А2	А1—244	А2—244
А2А2	А1 — нет амплификата	А2—244

Источник: выполнено Н.А. Худяковой, И.С. Кожевниковой, М.А. Кудриной.

Table 1
Characteristics of DNA fragments of CSN2 allelic variants

CSN2 genotypes	1 CSN2 amplification, bp	2 CSN2 amplification, bp
А1А1	А1—244	А2 — no amplification
А1А2	А1—244	А2—244
А2А2	А1 — no amplification	А2—244

Source: compiled by N.A. Khudyakova, I.S. Kozhevnikova, M.A. Kudrina.

Согласно Е.К. Меркурьевой рассчитывали: частоту встречаемости генотипов, частоту отдельных аллелей, критерий соответствия фактического и ожидаемого распределения частот генотипов хи-квадрат χ². Ожидаемое распределение генотипов определяли с помощью закона Харди — Вайнберга [8]. Для расчета статистических показателей использовалась программа Microsoft Excel 2021. Результаты представлены в виде Ме ± S (среднее значение ± ошибка среднего арифметического).

Результаты исследований и обсуждение

Данные по частоте встречаемости генотипов и аллелей бета-казеина крупного рогатого скота холмогорской породы в двух поколениях, полученные на базе АО «Холмогорский племзавод» и ООО «Агрофирма ”Холмогорская“», приведены в табл. 2.

Таблица 2
Полиморфизм гена бета-казеина крупного рогатого скота холмогорской породы

Поколение животных	Количество голов n	Тип распределений	Дочернее потомство								Х2
			А1А1		А1А2		А2А2		Частота аллелей
			n	%	n	%	n	%	А1	А2
АО «Холмогорский племзавод»
Матери	53	Н	14	26,4	31	58,5	8	15,1	0,56	0,44	1,81
		О	16	31,0	26	49,4	11	19,7
Дочери	53	Н	17	32,1	26	49,1	10	18,9	0,57	0,43	0,00
		О	17	32,0	26	49,2	10	18,8
ООО «Агрофирма ”Холмогорская“»
Матери	50	Н	14	28,0	30	60,0	6	12,0	0,58	0,42	2,68
		О	17	33,6	24	48,7	9	17,6
Дочери	50	Н	20	40,0	24	48,0	6	12,0	0,64	0,36	0,09
		О	21	41,0	23	46,1	6	13,0

Примечание. Н — наблюдаемое распределение генотипов; О — ожидаемое распределение генотипов.
Источник: выполнено Н.А. Худяковой, И.С. Кожевниковой, М.А. Кудриной.

Table 2
Polymorphism of the beta-casein gene in Kholmogory cattle

Animal generation	Number of animals, n	Distribution type	Offspring								Х2
			А1А1		А1А2		А2А2		Allele frequency
			n	%	n	%	n	%	А1	А2
Kholmogorskiy plemzavod
mothers	53	Н	14	26.4	31	58.5	8	15.1	0.56	0.44	1.81
		О	16	31.0	26	49.4	11	19.7
daughters	53	Н	17	32.1	26	49.1	10	18.9	0.57	0.43	0.00
		О	17	32.0	26	49.2	10	18.8
Agrofirma ʺKholmogorskayaʺ
mothers	50	Н	14	28.0	30	60.0	6	12.0	0.58	0.42	2.68
		О	17	33.6	24	48.7	9	17.6
daughters	50	Н	20	40.0	24	48.0	6	12.0	0.64	0.36	0.09
		О	21	41.0	23	46.1	6	13.0

Note. Н — observed distribution of genotypes; O — expected distribution of genotypes.
Source: compiled by N.A. Khudyakova, I.S. Kozhevnikova, M.A. Kudrina.

Отмечено преобладание в двух поколениях гетерозиготного генотипа бета-казеина, который составил 58,5 и 60,0 % у коров-­матерей и 49,1 и 48,0 % в дочернем потомстве (рис. 1). Исследования [3, 9] показывают, что гетерозиготный генотип положительно влияет как на показатели удоя, так и на массовую долю жира и белка в молоке крупного рогатого скота.

В обоих хозяйствах наблюдалось незначительное увеличение частоты встречаемости аллеля А1 и уменьшение частоты встречаемости аллеля А2 у дочернего потомства, что привело к возрастанию количества гомозиготных особей по аллелю А1 в дочернем потомстве (рис. 1). По данным исследователей, генотип А1А1 оказывает незначительное влияние на показатели по удою и жиру в молоке крупного рогатого скота [5, 8].

Так же в АО «Холмогорский племзавод» с увеличением количества голов с генотипом А1А1 увеличивалось и количество гомозиготных особей по аллелю А2 в дочернем потомстве, что составило 18,9 % или 10 голов (табл. 2, рис.). Исследователи отмечают, что генотип А2А2 положительно влияет на показатели молочной продуктивности, а именно удой и содержание белка в молоке [10—12, 14]. Животные с данным генотипом являются более востребованными для целенаправленного производства молока А2 [13, 15].

Ожидаемые значения частоты встречаемости генотипов бета-казеина практически не отличаются от фактически полученных результатов, что указывает на преобладание в исследуемых стадах системы случайного скрещивания. Рассчитанное значение χ² показывает на отсутствие смещения генетического равновесия изучаемой выборки животных.

Распределение частоты встречаемости генотипов бета-казеина в исследуемом стаде, %
Источник: выполнено Н.А. Худяковой, И.С. Кожевниковой, М.А. Кудриной.

Frequency distribution of beta-casein genotypes in the studied herd, %
Source: compiled by N.A. Khudyakova, I.S. Kozhevnikova, M.A. Kudrina.

Проведен анализ распределения генотипов по бета-казеину в дочернем потомстве (табл. 3).

Таблица 3
Распределение частот аллелей и генотипов по бета-казеину в дочернем потомстве

Генотип матерей	Количество голов матерей n	Тип распределений	Дочернее потомство								Х2
			А1А1		А1А2		А2А2		Частота аллелей
			n	%	n	%	n	%	А1	А2
АО «Холмогорский племзавод»
А1А1	14	Н	8	57,1	6	42,9	0	0	0,79	0,21	1,04
		О	9	61,7	5	33,7	0	4,6
А1А2	31	Н	9	29,0	15	48,4	7	22,6	0,53	0,47	0,02
		О	9	28,3	15	49,8	7	21,9
А2А2	8	Н	0	0	5	62,5	3	37,5	0,31	0,69	5,18
		О	0	9,8	3	43,0	4	47,3
ООО «Агрофирма ”Холмогорская“»
А1А1	14	Н	9	64,3	5	35,7	0	0	0,82	0,18	0,66
		О	10	67,5	4	29,3	0	3,2
А1А2	30	Н	11	36,7	14	46,7	5	16,7	0,60	0,40	0,02
		О	11	36,0	14	48,0	5	16,0
А2А2	6	Н	0	0	5	83,3	1	16,7	0,42	0,58	3,84
		О	0	17,4	3	48,6	2	34,0

Примечание. Н — наблюдаемое распределение генотипов; О — ожидаемое распределение генотипов.
Источник: выполнено Н.А. Худяковой, И.С. Кожевниковой, М.А. Кудриной.

Table
3Distribution of allele and genotype frequencies for beta-casein in offspring

Mothers’ genotype	Number of mothers n	Distribution type	Offspring								Х2
			А1А1		А1А2		А2А2		Allele frequency
			n	%	n	%	n	%	А1	А2
Kholmogorskiy plemzavod
А1А1	14	Н	8	57.1	6	42.9	0	0	0.79	0.21	1.04
		О	9	61.7	5	33.7	0	4.6
А1А2	31	Н	9	29.0	15	48.4	7	22.6	0.53	0.47	0.02
		О	9	28.3	15	49.8	7	21.9
А2А2	8	Н	0	0	5	62.5	3	37.5	0.31	0.69	5.18
		О	0	9.8	3	43.0	4	47.3
Agrofirma ʺKholmogorskayaʺ
А1А1	14	Н	9	64.3	5	35.7	0	0	0.82	0.18	0.66
		О	10	67.5	4	29.3	0	3.2
А1А2	30	Н	11	36.7	14	46.7	5	16.7	0.60	0.40	0.02
		О	11	36.0	14	48.0	5	16.0
А2А2	6	Н	0	0	5	83.3	1	16.7	0.42	0.58	3.84
		О	0	17.4	3	48.6	2	34.0

Note. Н — observed distribution of genotypes; O — expected distribution of genotypes.
Source: compiled by N.A. Khudyakova, I.S. Kozhevnikova, M.A. Kudrina.

В обоих стадах наблюдается доминирование аллеля А1, что, соответственно, влияет на наследование А1 аллельных вариантов генотипов, однако чаще встречается А1А2 генотип. Следовательно, вероятность наследования аллеля А2 дочерним потомством снижено, что может привести к уменьшению количества гомозиготных особей по данному аллелю в стаде.

У коров с генотипом А2А2 наблюдается смещение генетического равновесия у дочернего потомства в сторону гетерозиготного генотипа. Также при сравнении наблюдаемого и ожидаемого распределения генотипов бета-казеина видно, что в стадах преобладает случайное скрещивание.

С целью определить наиболее перспективный генотип для дальнейшей селекционной работы проведен анализ молочной продуктивности по показателям удоя, жира и белка в молоке за 305 дней первой лактации крупного рогатого скоты холмогорской породы в двух поколениях на базе АО «Холмогорский племзавод» и ООО «Агрофирма ”Холмогорская“». Из 103 пар животных с различными генотипами, используя критерий включения (законченная первая лактация коров и их дочернего потомства, наличие данных по показателям молочной продуктивности за 305 дней первой лактации у кров и их дочернего потомства), отобрали 66 пар коров и их дочернего потомства (табл. 4).

Таблица 4
Молочная продуктивность коров за 305 дней первой лактации при распределении генотипов по бета-казеину

Генотип	Матери		Дочери		Всего
	Количество голов n	Удой, кг	Количество голов n	Удой, кг	Количество голов n	Удой, кг
АО «Холмогорский племзавод»
А1А1	5	5660 ± 440	5	5743 ± 653	10	5701 ± 394
А1А2	16	6065 ± 136	17	5639 ± 186	33	5846 ± 122
А2А2	5	6094 ± 138	4	5365 ± 312	9	5770 ± 199
Всего	26	5993 ± 126	26	5617 ± 183	52	5805 ± 114
ООО «Агрофирма ”Холмогорская“»
А1А1	11	4705 ± 151	18	5172 ± 212	29	4995 ± 150
А1А2	26	4746 ± 120	17	5386 ± 274	43	4999 ± 139
А2А2	3	4950 ± 65	5	4843 ± 339	8	4883 ± 214
Всего	40	4750 ± 89	40	5222 ± 159	80	4986 ± 95

Источник: выполнено Н.А. Худяковой, И.С. Кожевниковой, М.А. Кудриной.

Table 4
Milk productivity of cows for 305 days of the first lactation with the distribution of genotypes by beta-casein

Genotype	Mothers		Daughters		Total
	Number of animals n	Milk yield, kg	Number of animals n	Milk yield, kg	Number of animals n	Milk yield, kg
Kholmogorskiy plemzavod
А1А1	5	5660 ± 440	5	5743 ± 653	10	5701 ± 394
А1А2	16	6065 ± 136	17	5639 ± 186	33	5846 ± 122
А2А2	5	6094 ± 138	4	5365 ± 312	9	5770 ± 199
Total	26	5993 ± 126	26	5617 ± 183	52	5805 ± 114
Agrofirma ʺKholmogorskayaʺ
А1А1	11	4705 ± 151	18	5172 ± 212	29	4995 ± 150
А1А2	26	4746 ± 120	17	5386 ± 274	43	4999 ± 139
А2А2	3	4950 ± 65	5	4843 ± 339	8	4883 ± 214
Total	40	4750 ± 89	40	5222 ± 159	80	4986 ± 95

Source: compiled by N.A. Khudyakova, I.S. Kozhevnikova, M.A. Kudrina.

В АО «Холмогорский племзавод» выявили 26 пар коров холмогорской породы. В среднем по лактации от коров всех генотипов и поколений надоено 5805 кг молока, при этом удой коров-­матерей был выше на 188 кг. В среднем по генотипам показатель по удою незначительно выше у коров с генотипов А1А2, однако среди матерей наиболее высокий и практически равный показатель имеют коровы с генотипом А2А2 и А1А2, а среди дочернего потомства — А1А1 и А1А2.

При сравнении коров в двух поколениях одного и того же генотипа видно, что коровы из группы дочернего потомства с генотипом А1А1 превзошли аналогов из группы матерей по удою на 84 кг, с генотипом А1А2 уступили на 426 кг, с генотипом А2А2 уступили на 729 кг.

В ООО «Агрофирма ”Холмогорская“» отобрали 40 пар коров холмогорской породы. В среднем по лактации от коров всех генотипов и поколений надоено 4986 кг молока, при этом удой дочернего потомства был выше на 236 кг. В среднем по генотипам показатель по удою незначительно выше у коров с генотипом А1А2, однако среди матерей наиболее высокий показатель имеют коровы с генотипом А2А2, а среди дочернего потомства — А1А2.

При сравнении коров в двух поколениях одного и того же генотипа видно, что коровы из группы дочернего потомства с генотипом А1А1 превзошли аналогов из группы матерей по удою на 467 кг, с генотипом А1А2 — на 640 кг, с генотипом А2А2 уступили на 107 кг.

Нами также проанализирована молочная продуктивность по первой лактации у дочерей-­коров с разными генотипами гена бета-казеина (табл. 5).

Таблица 5
Характеристика молочной продуктивности за 305 дней первой лактации  при распределении генотипов по бета-казеину в дочернем потомстве

Генотип матери	Генотип дочери	Количество голов дочерей n	Показатель	Удой за 305 дн по 1 л, кг	Жир,%	Белок,%	Количество жира, кг	Количество белка, кг
АО «Холмогорский племзавод»
А1А1	А1А1	1	M	5423	3,56	3,03	193	164
			m	—	—	—	—	—
	А1А2	4	M	5884	3,46	2,96	204	174
			m	404	0,18	0,11	6	5
А1А2	А1А1	4	M	5823	3,78	3,20	220	186
			m	811	0,21	0,06	27	25
	А1А2	10	M	5692	3,61*	3,14	206*	179
			m	247	0,11	0,05	9	7
	А2А2	2	M	5596	4,19*	3,34	234*	187
			m	239	0,16	0,10	1	2
А2А2	А1А2	3	M	5136	3,87	3,26	199	167
			m	160	0,08	0,04	8	4
	А2А2	2	M	5135	3,61	3,28	185	168
			m	528	0,15	0,03	27	19
ООО «Агрофирма ”Холмогорская“»
А1А1	А1А1	8	M	4867	3,67	2,99	179	145
			m	318	0,06	0,06	11	8
	А1А2	3	M	4953	3,67	3,06	182	151
			m	387	0,10	0,11	9	10
А1А2	А1А1	10	M	5416	3,61	3,09	195	168
			m	261	0,07	0,04	11	7
	А1А2	11	M	5010	3,74	3,16	187	158
			m	191	0,10	0,06	8	6
	А2А2	5	M	4843	3,63	3,04	176	147
			m	339	0,11	0,09	13	10
А2А2	А1А2	3	M	7197	3,45	3,02	248	217
			m	660	0,07	0,07	20	18

Примечание. Различие достоверны *р ≤ 0,05.
Источник: выполнено Н.А. Худяковой, И.С. Кожевниковой, М.А. Кудриной.

Table 5
Characteristics of milk production for 305 days of the first lactation with the distribution of genotypes for beta-casein in the offspring

Mother’s genotype	Daughter’s genotype	Number of daughters n	Index	Milk yield for 305 days, 1 liter, kg	Fat, %	Protein, %	Amount of fat, kg	Amount of protein, kg
Kholmogorskiy plemzavod
А1А1	А1А1	1	M	5423	3.56	3.03	193	164
			m	—	—	—	—	—
	А1А2	4	M	5884	3.46	2.96	204	174
			m	404	0.18	0.11	6	5
А1А2	А1А1	4	M	5823	3.78	3.20	220	186
			m	811	0.21	0.06	27	25
	А1А2	10	M	5692	3.61*	3.14	206*	179
			m	247	0.11	0.05	9	7
	А2А2	2	M	5596	4.19*	3.34	234*	187
			m	239	0.16	0.10	1	2
А2А2	А1А2	3	M	5136	3.87	3.26	199	167
			m	160	0.08	0.04	8	4
	А2А2	2	M	5135	3.61	3.28	185	168
			m	528	0.15	0.03	27	19
Agrofirma ʺKholmogorskayaʺ
А1А1	А1А1	8	M	4867	3.67	2.99	179	145
			m	318	0.06	0.06	11	8
	А1А2	3	M	4953	3.67	3.06	182	151
			m	387	0.10	0.11	9	10
А1А2	А1А1	10	M	5416	3.61	3.09	195	168
			m	261	0.07	0.04	11	7
	А1А2	11	M	5010	3.74	3.16	187	158
			m	191	0.10	0.06	8	6
	А2А2	5	M	4843	3.63	3.04	176	147
			m	339	0.11	0.09	13	10
А2А2	А1А2	3	M	7197	3.45	3.02	248	217
			m	660	0.07	0.07	20	18

Note: the difference is reliable *p ≤ 0.05.
Source: compiled by N.A. Khudyakova, I.S. Kozhevnikova, M.A. Kudrina.

В АО «Холмогорский племзавод» анализ результатов величины удоев за 305 дней первой лактации показал, что наибольшую продуктивность имеют дочери с генотипом А1А2 от коров с генотипом А1А1 — 5884 кг и дочери с генотипом А1А1 от коров с генотипом А1А2 — 5823 кг. Однако по качественному составу молока наивысшие показатели по массовой доле жира и белка, количеству молочного жира и белка имеют дочери с генотипом А2А2 от коров с генотипом А1А2.

В ООО «Агрофирма ”Холмогорская“» наивысший показатель по удою имеют дочери с генотипом А1А2 от коров с генотипом А2А2 — 7197 кг. По массовой доле жира и белка наибольший показатель имеют дочери с генотипом А1А2 от коров с генотипом А1А2 — 3,74 и 3,16 % соответственно. Наибольшее количество жира и белка имеют дочери с генотипом А1А2 от коров с генотипом А2А2.

Коровы с генотипом А1А2, как в среднем по выборке в двух хозяйствах, так и по поколениям в основном отличаются более высоким удоем. Следовательно, при использовании в подборе пар коров с генотипом А1А2 и А2А2 вероятность передачи аллеля А2 дочернему потомству достаточно велика, как и улучшение качественного состава молока.

Заключение

Таким образом, для производства высококачественной молочной продукции и эффективного ведения селекционных работ в хозяйствах необходимо увеличить количество животных, несущих генотип А2А2. В изучаемых стадах наблюдалось доминирование аллеля А1 и преобладание коров с гетерозиготным генотипом А1А2. В среднем в хозяйствах за 305 дней первой лактации коровы, несущие генотипы с аллельным вариантом А2 (А1А2 и А2А2), обладают наивысшими показателями по качественному и количественному составу молока.

Об авторах

Наталья Александровна Худякова

Федеральный исследовательский центр комплексного изучения Арктики имени академика Н.П. Лавёрова Уральского отделения Российской академии наук

Email: nata070707hudyakova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1302-2965
SPIN-код: 3906-2286

кандидат сельскохозяйственных наук, научный сотрудник лаборатории инновационных технологий в АПК

Российская Федерация, 163032, г. Архангельск, п. Луговой, д. 10

Ирина Сергеевна Кожевникова

Федеральный исследовательский центр комплексного изучения Арктики имени академика Н.П. Лавёрова Уральского отделения Российской академии наук; Северный (Арктический) федеральный университет имени М.В. Ломоносова

Email: kogevnikovais@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7194-9465
SPIN-код: 2441-2363

кандидат биологических наук, заведующий лаборатории инновационных технологий в АПК, Федеральный исследовательский центр комплексного изучения Арктики имени академика Н.П. Лаверова Уральского отделения Российской академии наук; доцент кафедры биологии человека и биотехнических систем, Северный арктический федеральный университет им. М.В. Ломоносова

Российская Федерация, 163032, г. Архангельск, п. Луговой, д. 10; Российская Федерация, г. Архангельск, Набережная Северной Двины, д. 17

Марина Александровна Кудрина

Федеральный исследовательский центр комплексного изучения Арктики имени академика Н.П. Лавёрова Уральского отделения Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: labinnovrazv@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8255-2989
SPIN-код: 4467-0807

младший научный сотрудник лаборатории инновационных технологий в АПК

Российская Федерация, 163032, г. Архангельск, п. Луговой, д. 10

Список литературы

Дополнительные файлы