Prospects of using antagonist strains for suppression of strawberry anthracnose pathogen

Full Text

Введение

Антракноз земляники, вызываемый грибами комплекса Colletotrichum acutatum, представляет собой одну из наиболее агрессивных болезней культуры во всем мире. Патоген поражает все части растения, приводя к появлению некрозов, язв, пятен на вегетативных частях, а также к загниванию и мумификации ягод, что делает продукцию непригодной для реализации и потребления.

Основные методы борьбы с антракнозом — это выведение новых сортов земляники садовой и применение фунгицидов. Сорта, широко представленные в ассортименте, не устойчивы к возбудителям антракноза.

Применение химических средств на землянике садовой имеет свои ограничения: короткий вегетационный период, использование ягод в свежем виде, развитие резистентности патогенов.

При интенсификации производства и увеличении потребности населения в свежих ягодах ^[1] все более актуальными становятся разработка и внедрение альтернативных подходов в защите растений. Биопрепараты позволяют не только подавлять развитие фитопатогенов, но, как правило, опосредованно влиять на устойчивость растений, через индукцию системной резистентности. Несмотря на распространенность антракноза земляники, на рынке пестицидов и биофунгицидов отсутствуют специализированные препараты ^[2].

Цель исследования — получить штаммы бактерий, которые являются потенциальными биоагентами в борьбе с возбудителями антракноза земляники рода Colletotrichum.

Материалы и методы исследования

Возбудителя антракноза выявили в посадочном материале земляники. Выделение проводили в соответствии со стандартной методикой работы с грибными патогенами: закладка образцов растений во влажную камеру и на питательную среду (картофельно-глюкозный агар 2%). Бактериальные штаммы получены из коллекции Всероссийского центра карантина растений (ФГБУ «ВНИИКР»).

Видовую принадлежность патогена подтверждали культурально-морфологическим и молекулярным методами. Для определения нуклеотидных последовательностей методом Сэнгера использовали базовый участок внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS1–5,8S-ITS2) с праймерами ITS4/ITS5 и участок гена глицеральдег‑3‑фосфатдегидрогеназы (GAPDH) праймерами GDF/GDR, маркерный для данного комплекса видов локус.

Для идентификации бактерий колонии отбирали с питательной среды R2A, а затем выделяли ДНК. Далее проводили секвенирование по Сэнгеру с праймерами 27F/907R на участок гена 16S рРНК.

Результаты секвенирования обрабатывали с помощью программы BioEdit ^[3]. Расшифрованные нуклеотидные последовательности сравнивали с помощью сервиса BLAST с последовательностями, размещенными в базе данных NCBI GenBank ^[4]. Результатом идентификации считали организм с максимальным сходством (Max score), автоматически вычисленным сервисом BLAST на основании расчета показателей Query coverage и Percent identity [1].

Антагонистическую активность определяли методом встречных культур на пептонно-дрожжевом глюкозном агаре (YPGA). Мицелиальную высечку патогена помещали в центр чашки, бактерии высевали параллельными штрихами на расстоянии 2,5 см от центра. Чашки инкубировали при 25 ± 1 °C в течение 14 суток. Измерение радиуса роста мицелия проводили на 5-, 7- и 14‑е сутки. Повторность опыта трехкратная. Для оценки результатов рассчитывали показатель ингибирования мицелиального роста гриба бактерией по формуле

Р = (K – A) / K×100 %,

где P — показатель ингибирования (ПИ), %; K — рост гриба в контроле, мм; A — рост гриба в опыте, мм.

Биохимические свойства изучали с помощью тест-системы API 20 E (bioMérieux, Франция), оценивая ферментативную активность по 20 субстратам, включая ферментацию углеводов, декарбоксилирование аминокислот, продукцию сероводорода, индола и ацетоина, активность уреазы и желатиназы.

Экспериментальные данные обрабатывали в RStudio (v4.3.1).

Результаты исследования и обсуждение

Морфологический и генетический анализ подтвердил принадлежность изолята к виду C. nymphaeae (комплекс C. acutatum) — основному и наиболее агрессивному возбудителю болезней садовой земляники. Выравнивание по участку GAPDH показало 100%-ю идентичность с эталонным штаммом (GenBankID = JQ948527.1) (типовой образец) C. nymphaeae.

Для оценки антагонистической активности протестировали 43 бактериальных изолята из коллекции ФГБУ «ВНИИКР» (табл. 1). В ходе опыта 22 изолята бактерий значимо подавляли рост мицелия C. Nymphaeae, из них 7 изолятов имели показатель ингибирования больше или равный 60 %. Получены результаты — показатель ингибирования роста мицелия патогена изучаемыми штаммами бактерий и показатель p-value, отображающий достоверность различий в росте мицелия патогена в контроле и опыте. Значительная вариабельность антагонистической активности среди штаммов обусловлена их таксономическим разнообразием. Изоляты с уровнем ингибирования больше или равным 60 % выделены зеленым цветом.

 Таблица 1 / Table 1
Влияние исследуемых изолятов на рост C. Nymphaeae / Effect of the studied bacterial isolates on the growth of C. nymphaeae

№ п/п / No.	№ изолята / Isolate No.	Видовая принадлежность / Species	Показатель ингибирования, % / Inhibition index, %	p-value
	0070	Pseudomonas bohemica	36,53	0,1644
	0071	Priestia aryabhattai	25,17	0,3684
	0073	Priestia aryabhattai	53,86	0,0402
	0074	Pantoea agglomerans	30,48	0,2586
	0075	Alcaligenes faecalis	67,89	0,0073
	0076	Bacillus subtilis	62,60	0,0090
	0077	Sphingomonas paucimobilis	19,47	0,4824
	0078	Azohydromonas sediminis/ Bacillus subtilis/ Bacillus stercoris	57,74	0,0204
	0080	Paenibacillus polymyxa	48,23	0,0861
	0081	Priestia aryabhattai	40,26	0,0371
	0082	Priestia aryabhattai	52,85	0,0530
	0084	Ochrobactrum sp	73,39	0,0204
	0085	Priestia aryabhattai	33,99	0,1956
	0086	Priestia aryabhattai	42,95	0,0261
	0087	Priestia aryabhattai/ Priestia megaterium	32,60	0,2287
	0089	Bacillus subtilis	66,34	0,0060
	0359	Pseudomonas azotoformans	55,28	0,0082
	0469	Achromobacter sp.	45,11	0,0265
	0483	Priestia aryabhattai	49,32	0,0112
	0484	Priestia aryabhattai	58,19	0,0086
	0485	Priestia aryabhattai / Priestia megaterium	19,25	0,4904
	0486	Chryseobacterium soldanellicola	21,19	0,4603
	0488	Pantoea agglomerans	51,26	0,0114
	0489	Microbacterium paraoxydans	21,80	0,3840
	0537	Pseudomonas fluorescens	50,46	0,0131
	0541	Pseudomonas fluorescens	43,39	0,0346
	0548	Pseudomonas fluorescens	53,40	0,0108
	0552	Bacillus australimaris / Bacillus safensis	60,95	0,0094
	0579	Priestia aryabhattai	25,67	0,0541
	0582	Ralstonia insidiosa	30,49	0,1340
	0583	Ralstonia insidiosa	28,72	0,0632
	0584	Priestia aryabhattai	41,62	0,1125
	0585	Bacillus tequilensis / Bacillus subtilis	67,36	0,0091
	0587	Bacillus amyloliquefaciens / Bacillus velezensis	51,91	0,0543
	0590	Moraxella tetraodonis	22,33	0,4437
	0591	Ralstonia insidiosa	18,98	0,5931
	0592	Bacillus siamensis / Bacillus amyloliquefaciens / Bacillus velezensis	49,68	0,0748
	0593	Rurimicrobium arvi / Rhodococcus cercidiphylli / Staphylococcus hominis	25,80	0,3558
	0699	Bacillus pumilus	48,23	0,0153
	0701	Achromobacter sp.	45,77	0,0235
	0708	Bacillus pumilus	57,52	0,0076
	0739	Bacillus velezensis	86,82	0,0066
	0756	Pseudomonas putida	45,44	0,0239

Примечание. Зеленым цветом выделен показатель ингибирования больше или равный 60 %, желтым цветом — значение p-value < 0,05, что указывает на достоверность различий в росте мицелия в контроле и в опыте. Подсчет проводился по тесту Краскела — Уоллиса с пост-хок тестом Данна с поправкой Бенджамини — Хохберга.
Источник: составлено А.В. Смирновой, Ю.В. Цветковой.
Note. Inhibition values greater than or equal to 60% are highlighted in green, while p-values < 0.05 are highlighted in yellow, indicating significant differences in mycelial growth between the control and experimental samples. Calculations were performed using the Kruskal-Wallis test with Dunn’s post-hoc test and the Benjamini ― Hochberg correction.
Source: compiled by A.V. Smirnova, Y.V. Tsvetkova.

На 7 сутки наибольшую антагонистическую активность в отношении C. nymphaeae (ПИ > 60 %) показали следующие 7 изолятов (в скобках приведен показатель ингибирования): 0075 — Alcaligenes faecalis (67,89 %), 0076 — Bacillus subtilis (62,60 %), 0084 — Ochrobactrum sp. (73,39 %), 0089 — Bacillus subtilis (66,34 %), 0552 — Bacillus australimaris/ Bacillus safensis (60,95 %), 0585 — Bacillus tequilensis / Bacillus subtilis (67,36 %), 0739 — Bacillus velezensis (86,82 %) (рис.).

Скрининг бактериальных изолятов в отношении C. nymphaeae
Источник: выполнено А.А. Петрухиной.
Screening of bacterial isolates against C. nymphaeae
Source: compiled by A.A. Petrukhina.

Изоляты 0076 и 0089 относятся к Bacillus subtilis. Вид проявляет антибиотическую активность против фитопатогенов, а также повышает иммунитет растений. Эти изоляты используются в сельском хозяйстве в качестве основы для биопрепаратов, в т.ч. против возбудителей антракноза [1–3].

Изолят 0739 — Bacillus velezensis — обладает антагонистическими свойствами в отношении: Botrytis cinerea, Pythium sp., Phytophtora sp., Sclerotinia sp., Penicillium sp., Alternaria alternate, Macrophomina phaseolina и Rhizoctonia solani [4].

Изолят 0585 с идентичностью в 99,41 % был определен как Bacillus tequilensis или Bacillus subtilis. Изоляты B. tequilensis обладают антагонистической активностью против грибных патогенов на пшенице, бананах и ряде других культур, в т. ч. в отношении C. acutatum на красном перце [5].

Изолят 0552 с идентичностью в 98,45 % определили как Bacillus australimaris или Bacillus safensis. Вид B. australimaris используется для биоконтроля, например, против Alternaria alternata [6]. Некоторые изоляты вида B. safensis проявляют антибиотическую активность и отмечаются как перспективные агенты биоконтроля в отношении ряда патогенных бактерий и грибов [7].

Изолят 0075 — Alcaligenes faecali. Метаболиты A. faecalis обладают противогрибной и антибактериальной активностью, в т.ч. подавляют рост грибов Colletotrichum gloeosporioides [8].

Изолят 0084 — Ochrobactrum sp. Отдельные виды рода эффективны в биоконтроле фитопатогенов. O. intermedium показал высокую эффективность против Colletotrichum falcatum на растениях сахарного тростника, сравнимую с действием карбендазима [9]. В другом исследовании показано, что культуральный фильтрат O. anthropi полностью подавил рост грибов рода Colletotrichum [10].

Биохимические свойства отобранных перспективных бактериальных изолятов исследовали с помощью тест-системы API 20E. Анализ их метаболических особенностей позволяет косвенно оценить потенциальную фитотоксичность и адаптивную способность штаммов. Результаты приведены в табл. 2.

У всех семи изолятов отмечена высокая активность углеводного метаболизма (3 и более положительных теста 12–20; GLU–ARA), что свидетельствует о метаболической пластичности и способности к эффективной колонизации филлосферы и ризосферы растений. Отсутствие утилизации амигдалина (AMY) изолятами 0075, 0076, 0089 и D-мелибиозы (MEL) изолятом 0084 существенно не снижает их метаболического потенциала, поскольку штаммы способны утилизировать большое количество других субстратов [11].

Метаболизм ароматических аминокислот оценивали по тестам TDA, IND и VP. Все исследуемые изоляты проявляли триптофандеаминазную активность (TDA), характерную для ризосферных и эпифитных бактерий, и не синтезировали индол‑3‑уксусную кислоту (отрицательный IND), что исключает путь, типичный для фитопатогенов [11]. Положительная VP-активность (синтез ацетоина) указывает на потенциальную способность стимулировать рост растений и индуцировать устойчивость к патогенам [12]. Например, ацетоин и 2,3‑бутандиол, продуцируемые бактериями рода Bacillus, способны усиливать устойчивость растений к Pectobacterium carotovorum и Pseudomonas syringae, а также стимулировать рост растений и увеличивать урожайность семян у Arabidopsis [12]. Однако способность к синтезу ацетоина не исключает возможности проявления фитотоксичности некоторых штаммов в стрессовых для них условиях.

Отрицательные результаты тестов ADH, LDC и ODC свидетельствуют об отсутствии у изолятов ферментов деградации аргинина, лизина и орнитина. Положительная активность ADH (аргининдигидролаза) могла бы указывать на способность регулировать pH ризосферы через выделение аммиака [13]. Активность LDC (лизиндекарбоксилаза) связана с синтезом кадаверина, который участвует в развитии корневой системы, способствует стрессоустойчивости и прорастанию семян [14]. ODC-активность (орнитиндекарбоксилаза) связана с продукцией путресцина, который увеличивает стрессоустойчивость растений, а также стимулирует рост корней и побегов [15]. Отсутствие этих активностей ограничивает потенциальное положительное влияние изолятов на растения через данные метаболические пути.

Положительный результат теста CIT у изолята 0084 свидетельствует о способности к утилизации цитрата, что указывает на альтернативный энергетический метаболизм при дефиците углеводов [16]. Отрицательные результаты теста H₂S у всех изолятов исключают продукцию сероводорода, который, по последним данным, участвует в регуляции стрессоустойчивости, роста растений и симбиотической фиксации азота [17].

Таблица 2 / Table 2

Результаты оценки биохимических свойств изолятов с помощью системы тестов API 20 E / The results of evaluation
of biochemical properties  of isolates using the API 20 E test system

Шифр

Название

Субстрат

ONPG

ADH

LDC

ODC

CIT

H2S

URE

TDA

IND

VP

GEL

GLU

MAN

INO

SOR

RHA

SAC

MEL

AMY

ARA

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

0075

Alcaligenes faecalis

+

–

–

–

–

–

–

+

–

+

+

+

+

+

+

+

+

+

–

+

0076

Bacillus subtilis

+

–

–

–

–

–

–

+

–

+

–

+

+

+

+

+

+

+

–

+

0084

Ochrobactrum sp.

+

–

–

–

+

–

–

+

–

+

+

+

+

+

+

+

+

–

+

+

0089

Bacillus subtilis

+

–

–

–

–

–

–

+

–

+

+

+

+

+

+

+

+

+

–

+

0552

Bacillus australimaris/ Bacillus safensis

+

–

–

–

–

–

–

+

–

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

0585

Bacillus tequilensis/ Bacillus subtilis

+

–

–

–

–

–

―

+

–

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

0739

Bacillus velezensis

–

–

–

–

–

–

–

+

–

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Примечание. Субстраты, представленные в системе тестов: 2‑нитрофенил-βD-галактопиранозид (ONPG), L-аргинин (ADH), L-лизин (LDC), L-омитин (ODC), цитрат натрия (CIT), тиосульфат натрия (H₂S), мочевина (URE), L-триптофан (TDA), индол (IND), пируват натрия (VP), желатин (GEL), D-глюкоза (GLU), D-маннит (MAN), инозит (INO), D-сорбит (SOR), L-рамноза (RHA), D-сахароза (SAC), D-мелибиоза (MEL), амигдалин (AMY), L-арабиноза (ARA).
Note. Substrates included in the test system: 2‑nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG), L-arginine (ADH), L-lysine (LDC), L-omitin (ODC), sodium citrate (CIT), sodium thiosulfate (H₂S), urea (URE), L-tryptophan (TDA), indole (IND), sodium pyruvate (VP), gelatin (GEL), D-glucose (GLU), D-mannitol (MAN), inositol (INO), D-sorbitol (SOR), L-rhamnose (RHA), D-sucrose (SAC), D-melibiose (MEL), amygdalin (AMY), L-arabinose (ARA).
Источник: составлено Д.А. Доморацкой.
Source: compiled by D.A. Domoratskaya.

Положительные результаты теста ONPG для всех изолятов кроме 0739 указывают на их способность расщеплять лактозоподобные субстраты, что повышает их адаптивный потенциал. Отрицательные результаты теста URE исключают продукцию уреазы и связанное с ней подщелачивание ризосферы, предотвращая потенциальную аммиачную токсичность для растений [18].

Отсутствие желатиназной активности (GEL) свидетельствует о низком протеолитическом потенциале, что снижает риски повреждения растительных тканей, характерных для фитопатогенов [19].

Заключение

В ходе исследования идентифицировано и отобрано для дальнейшего исследования семь штаммов бактерий, проявляющих высокую антагонистическую активность в отношении патогена C. nymphaeae, входящего в видовой комплекс Colletotrichum acutatum. Наиболее эффективными оказались следующие: 0075 — Alcaligenes faecalis, 0076 — Bacillus subtilis, 0084 — Ochrobactrum sp., 0089 — Bacillus subtilis, 0552 — Bacillus australimaris/ Bacillus safensis, 0585 — Bacillus tequilensis / Bacillus subtilis, 0739 — Bacillus velezensis.

На основании литературных данных и анализа биохимических профилей можно предположить, что отобранные изоляты не являются фитотоксичными и обладают высоким адаптивным потенциалом к колонизации растений. Данные штаммы представляются перспективными для разработки нового биопрепарата против антракноза земляники. Внедрение такого биологического средства защиты обеспечит экологическую безопасность сельскохозяйственной продукции и эффективный контроль над патогеном.

 

 

^{1 FAO // Food and Agriculture Organization of the United Nations. Режим доступа: https://www.fao.org/home/en (даита обращения: 12.11.2025).}

^{2 Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации и дополнения к нему // Министерство сельского хозяйства РФ. Режим доступа: https://mcx.gov.ru/ (дата обращения: 12.11.2025).}

^{3 BioEdit. Режим доступа: https://bioedit.software.informer.com/}

^{4 NCBI GenBank. Режим доступа: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov}

About the authors

Yulia V. Tsvetkova

All-Russian Plant Quarantine Center; Lomonosov Moscow State University

Email: yutska@mail.ru
Researcher, Mycology Laboratory, Testing Laboratory Center, All-Russian Plant Quarantine Center; postgraduate student, Mycology and Algology Department, Lomonosov Moscow State University 32 Pogranichnaya st., Bykovo, 140150, Russian Federation; 1 Leninskie Gory, Moscow, 119991, Russian Federation

Anna V. Smirnova

All-Russian Plant Quarantine Center

Author for correspondence.
Email: anna.smirnova2328@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0001-4827-1980
SPIN-code: 5449-5330

Junior Researcher, Mycology and Helminthology Department

32 Pogranichnaya st., Bykovo, 140150, Russian Federation

Anastasia A. Petrukhina

All-Russian Plant Quarantine Center

Email: anast.suglobova@gmail.com
ORCID iD: 0009-0002-2951-9386
SPIN-code: 4281-8197

Junior Researcher, Scientific and Methodological Department of Mycology and Helminthology

32 Pogranichnaya st., Bykovo, 140150, Russian Federation

Dana A. Domoratskaya

All-Russian Plant Quarantine Center

Email: danadomoratskaya@mail.ru
ORCID iD: 0009-0005-9362-6655
SPIN-code: 8506-7534

Junior Researcher, Laboratory of Bacteriology and Analysis of Genetically Modified Organisms, Testing Laboratory Center

32 Pogranichnaya st., Bykovo, 140150, Russian Federation

Anastasia B. Yaremko

All-Russian Plant Quarantine Center

Email: an_ya94@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3295-8080
SPIN-code: 4456-1312

Junior Researcher, Molecular Genetics Shared Use Center

32 Pogranichnaya st., Bykovo, 140150, Russian Federation

References

Supplementary files