Analysis of differential expression of glycinin and β-conglycinin genes in Europeanand Canadian soybean varieties

Anastasiya A. Katrushenko; Катрушенко Анастасия Андреевна; Alena A. Ivaniy; Иваний Алена Андреевна; Andrei A. Penzin; Пензин Андрей Андреевич; Anna P. Galichenko; Галиченко Анна Петровна; Pavel D. Timkin; Тимкин Павел Дмитриевич

doi:10.22363/2312-797X-2026-21-2-234-248

Analysis of differential expression of glycinin and β-conglycinin genes in Europeanand Canadian soybean varieties

Authors: Katrushenko A.A.¹, Ivaniy A.A.¹, Penzin A.A.¹, Galichenko A.P.¹, Timkin P.D.¹
Affiliations:
1. All-Russian Research Institute of Soybean
Issue: Vol 21, No 2 (2026)
Pages: 234-248
Section: Genetics and plant breeding
URL: https://agrojournal.rudn.ru/agronomy/article/view/20356
DOI: https://doi.org/10.22363/2312-797X-2026-21-2-234-248
EDN: https://elibrary.ru/JIHMQW
ID: 20356

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is a major source of high-quality protein for food and feed. The seed storage proteins, glycinin (11S) and β-conglycinin (7S), differ in amino acid composition and functional properties, and their ratio is a key determinant of soybean quality. This study aimed to analyze the differential expression of glycinin and β-conglycinin genes in European and Canadian soybean varieties to assess their storage protein profiles. Six European and Canadian soybean varieties (ESG 1813, RTZh Spida, Me 5, Mu 5 - France; N.S. Katya - Serbia; Сassidy - Canada) were grown in 2023-2024 at All-Russian Research Institute of Soybean, Amur region. Total RNA was isolated from mature seeds, cDNA was synthesized, and expression levels of Gy1-Gy5, Gy7, Cg1, Cg3, and Cg4 genes were analyzed by quantitative real-time PCR. The Tubulin gene was used as an internal reference. Relative expression was calculated using the 2^-ΔΔCt method. All primers showed high specificity confirmed by single melting peaks. Gy7 gene expression was not detected in any variety, consistent with its loss or suppression during breeding. Most varieties displayed conserved expression profiles for Gy1, Gy2, and Gy3. Two varieties exhibited unique expression patterns: Cassidy (Canada) showed significantly increased Gy4 expression, and Mu 5 (France) showed significantly increased Gy5 expression (p < 0.05). RTZh Spida (France) demonstrated significantly elevated Cg3 expression. Based on total glycinin/β-conglycinin transcript ratios, varieties were clearly divided into high-glycinin (Mu 5 - 86%, Cassidy - 82%, Me 5 - 64%) and high-β-conglycinin (N.S. Katya - 67%, RTZh Spida - 63%, ESG 1813 - 53%) groups. The observed 11S/7S ratio range (0.5-6.1) substantially exceeded previously reported values for American and Brazilian cultivars. The identified donor varieties (Cassidy - high Gy4 expression, Mu 5 - high Gy5 expression, RTZh Spida - high Cg3 expression) represent valuable genetic resources for Russian breeding programs. They can be used to introgress regulatory alleles for targeted manipulation of storage protein composition, enabling the development of new soybean cultivars with optimized protein quality and technological properties adapted to agroclimatic conditions of the Russian Federation.

Keywords

Glycine max, qPCR, seed storage proteins, PCR, Gy (1-5), Gy7 genes, Cg1, Cg3, Cg4 genes

Full Text

Введение

Соя (Glycine max (L.) Merr.) — одна из ключевых зернобобовых культур в мировом масштабе — служит основным источником высококачественного белка для пищевых и кормовых продуктов [1, 2]. Питательная и технологическая ценность получаемых из сои производных напрямую определяется составом и соотношением ее запасных белков [3, 4].

Основную долю (до 70…80 %) семенного протеина составляют два глобулина — глицинин (11S) и β-конглицинин (7S) [5, 6]. Эти белки имеют принципиальные структурные и функциональные различия. Глицинин, обладая более сбалансированным аминокислотным составом с высоким содержанием серосодержащих аминокислот, определяет высокую питательную ценность. В то же время β-конглицинин, практически лишенный цистеина и метионина, оказывает значительное влияние на функционально-технологические свойства, такие как эмульгирующая и гелеобразующая способность [7, 8]. Таким образом, соотношение глицинина и β-конглицинина — критически важный параметр качества семян, определяющий их дальнейшее целевое использование [9].

Данное соотношение носит генетически детерминированный характер и контролируется активностью мультигенных семейств. Субъединицы глицинина кодируются генами Gy1–Gy5 и Gy7, а β-конглицинина — генами Cg1, Cg3 и Cg4 [10, 11]. Дифференциальная экспрессия этих генов лежит в основе межсортовой изменчивости белкового профиля. Для точного количественного анализа экспрессии в современной молекулярной биологии стандартом является метод количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (кПЦР) [12].

Несмотря на значительный объем исследований в области генетики и протеомики сои, систематические данные по сравнительному анализу экспрессии генов запасных белков у современных зарубежных сортов, представляющих интерес для селекционных программ в специфических агроклиматических условиях России, остаются фрагментарными. Международные сорта часто используются в мировой практике в качестве генетических доноров ценных признаков и референтных образцов для сравнительных исследований. Их детальная молекулярная характеристика необходима для эффективного использования в российской селекции, направленной на создание высокопродуктивных сортов с адаптивным потенциалом и заданным качеством белка.

Цель исследования — сравнительный анализ профилей экспрессии генов глицининов (Gy1, Gy2, Gy3, Gy4, Gy5, Gy7) и β-конглицининов (Cg1, Cg3, Cg4) у набора перспективных сортов сои из Франции, Сербии и Канады.

Материалы и методы исследования

Полевой опыт был заложен в 2023 и 2024 гг. на опытном поле ФГБНУ ФНЦ ВНИИ сои (село Садовое, Тамбовский район, Амурская область) на участках полевого севооборота. В исследовании использовали семена шести сортов европейской и канадской селекции, отобранные в фазе полной спелости (стадия R8): ЕСГ 1813, РТЖ Спида, Ме 5 и Мю 5 (Франция), Н.С. Катя (Сербия) и Кассиди (Канада). Выбирали исследуемые объекты в соответствии со стратегией привлечения сортов-доноров с целевыми хозяйственно ценными признаками. Такие сорта служат в мировой практике референтными образцами для сравнительного анализа генетического разнообразия и профилей экспрессии генов, контролирующих важные компоненты качества, такие как белковый состав [13]. Для повышения надежности результатов анализ проводили по материалу, собранному в течение двух последовательных вегетационных сезонов (2023 и 2024 гг.). Для каждого сорта и каждого года выращивания сформировали отдельный биологический повтор.

Для выделения тотальной РНК зрелые семена каждого сорта от каждого года исследований измельчали в порошок в жидком азоте. Из навески массой 0,05 г тотальную РНК выделяли с использованием набора HiPure Plant RNA Mini Kit (Magen Biotechnology, Китай) в строгом соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию и чистоту полученной РНК оценивали на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США); для всех образцов соотношение A260/A280 находилось в диапазоне 1,8…2,0. На основе выделенной РНК синтезировали первую цепь кДНК с использованием набора для обратной транскрипции M–MuLV–RH (Биолабмикс, Россия) и олиго(dT)16‑праймера. Стандартная реакционная смесь объемом 30 мкл содержала: 4 мкл матричной РНК, 4 мкл олиго(dT)16‑праймера, 8 мкл 5× реакционного буфера, 2 мкл 10 мМ dNTP, 4 мкл 0,1 М ДТТ, 2 мкл ревертазы M–MuLV–RH (100 ед./мкл) и 6 мкл воды, обработанной ДЭПК. Перед добавлением фермента смесь РНК и праймера инкубировали 3 минуты при 70 °C для денатурации вторичных структур, затем быстро охлаждали на льду. Реакцию обратной транскрипции проводили при 42 °C в течение 30 минут. Полученную кДНК использовали в качестве матрицы для последующего ПЦР-анализа.

Анализ экспрессии генов глицининов (Gy1, Gy2, Gy3, Gy4, Gy5, Gy7) и β-конглицининов (Cg1, Cg3, Cg4) проводили методом количественной ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США). Для каждого гена использовали специфичные пары праймеров (табл.).

Последовательности пар праймеров

Локус (номер пары праймеров)	ID транскрипта	Прямой праймер	Обратный праймер	Длина ампликона
Gy1	KRH67385	GAAGAGGATGAGAAGCCACA	TGTCAGGTGATGAAGTCTGG	151
Gy2	KRH67383	AGACCGTCACCAAAAGGTA	CAACAACAGGAGTGTCTTCA	104
Gy3	KRG95667	ACAACACAAACATTCTCTCCA	CTCTCTGAAACTGAAAGCGA	118
Gy4	KRH32185	ACAAGCATGATGGTGTGAGG	CGATTGAAAGGTACAACGCC	142
Gy5	KRH19559	TGGAAGAGGATGTCAGACTA	AGACTGTTGAGGGTGCTAAT	135
Gy7	KRG95666	TGAAGGTGGGGATAACAAAG	GGGTCTTGGGTTTTTCTTCT	138
Cg‑1	KRH35498	CACCAACCTCATCAAAAGGA	TCTTTGTCTTGCTCCTCATC	122
Cg‑3	KRG91330	TACTATGATGAGAGCACGGT	TGGAGACACTTGTTGTGTTT	123
Cg‑4	KRG91303	GAACAAATTCGGCAACTGAG	CAGGGGTGATCTCAAAGAAC	139

Источник: выполнено А.А. Катрушенко, П.Д. Тимкиным.

Sequences of primer pairs

Locus (number of the primer pair)	Transcript ID	Forward primer	Reverse primer	Amplicon length
Gy1	KRH67385	GAAGAGGATGAGAAGCCACA	TGTCAGGTGATGAAGTCTGG	151
Gy2	KRH67383	AGACCGTCACCAAAAGGTA	CAACAACAGGAGTGTCTTCA	104
Gy3	KRG95667	ACAACACAAACATTCTCTCCA	CTCTCTGAAACTGAAAGCGA	118
Gy4	KRH32185	ACAAGCATGATGGTGTGAGG	CGATTGAAAGGTACAACGCC	142
Gy5	KRH19559	TGGAAGAGGATGTCAGACTA	AGACTGTTGAGGGTGCTAAT	135
Gy7	KRG95666	TGAAGGTGGGGATAACAAAG	GGGTCTTGGGTTTTTCTTCT	138
Cg‑1	KRH35498	CACCAACCTCATCAAAAGGA	TCTTTGTCTTGCTCCTCATC	122
Cg‑3	KRG91330	TACTATGATGAGAGCACGGT	TGGAGACACTTGTTGTGTTT	123
Cg‑4	KRG91303	GAACAAATTCGGCAACTGAG	CAGGGGTGATCTCAAAGAAC	139

Source: compiled by A.A. Katrushenko, P.D. Timkin.

В качестве референтного гена для нормализации данных использовали ген Tubulin (TUB), характеризуемый стабильным уровнем экспрессии [15]. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала: 12,5 мкл реакционной смеси БиоМастер HS-qPCR SYBR Blue (2×) (Биолабмикс, Россия), по 1,25 мкл прямого и обратного праймеров (конечная концентрация 0,5 мкМ), 1 мкл кДНК и 9 мкл стерильной воды. Протокол амплификации включал начальную денатурацию при 96 °C в течение 2 минут, затем 32 цикла: денатурация при 94 °C — 30 секунд, отжиг праймеров при 66 °C — 40 секунд, элонгация при 70 °C — 1 минута. Завершающая элонгация проводилась при 70 °C в течение 2 минут. После амплификации для каждого образца регистрировали кривую плавления для подтверждения специфичности реакции. Для каждого образца кДНК (сорт × год) анализ проводили в двух аналитических повторностях (технических репликах).

Относительный уровень экспрессии каждого целевого гена рассчитывали методом 2^–ΔΔCt с использованием гена TUB в качестве эндогенного контроля [14]. Статистическую обработку данных проводили с использованием библиотек pandas, scipy.stats и statsmodels в среде программирования Python 3.9. Для оценки достоверности различий в уровне экспрессии между сортами и между годами применяли двухфакторный дисперсионный анализ (Two-way ANOVA) с учетом факторов «сорт» и «год выращивания», а также их взаимодействия. Предварительно проверяли соответствие данных допущениям ANOVA: нормальность распределения с помощью критерия Шапиро — Уилка; гомогенность дисперсий — критерия Левена. В случае значимого основного эффекта для попарного сравнения средних использовали post-hoc тест Тьюки (Tukey’s HSD). Различия считали статистически значимыми при уровне p < 0,05.

Результаты исследования и обсуждение

На первом этапе исследования оценивали специфичность разработанных праймеров методом анализа кривых плавления (рис. 1).

Для всех исследуемых генов — Gy1, Gy2, Gy3, Gy4, Gy5, Cg1, Cg3, Cg4 — зарегистрированы единичные пики (66 °C). Ген Gy7 в анализ не включен в связи с низкой экспрессионной активностью.

Анализ относительной экспрессии генов глицининов выявил консервативность экспрессионных профилей у большинства исследованных сортов (рис. 2).

Рис. 1. Кривые плавления праймеров
Источник: выполнено П.Д. Тимкиным.

Fig. 1. Primer melting curves
Source: compiled by P.D. Timkin.

Рис. 2. Уровень экспрессии генов глицининов и β-конглицининов: * – уровень достоверности при p < 0,05
Источник: выполнено П.Д. Тимкиным.

Fig. 2. Expression level of glycinin and β-conglycinin genes: * – confidence level at p-value < 0.05
Source: compiled by P.D. Timkin.

Сорта ЕСГ 1813, РТЖ Спида, Н.С. Катя и Ме 5 демонстрируют сходные уровни экспрессии всех пяти генов семейства Gy, что указывает на стабильность регуляторных механизмов, контролирующих биосинтез глицининов. Исключениями стали два сорта: Кассиди (Канада) демонстрирует достоверно повышенную экспрессию гена Gy4 (p = 0,023), а Мю 5 (Франция) — достоверно повышенную экспрессию гена Gy5 (p = 0,017).

Анализ экспрессии генов β-конглицининов (см. рис. 2) также показал высокую стабильность у большинства сортов. Уровни транскриптов генов Cg1 и Cg4 варьируют незначительно между образцами. Единственным статистически значимым исключением являются сорта РТЖ Спида (Франция) и Н.С. Катя (Сербия). У РТЖ Спида зарегистрирована достоверно повышенная экспрессия гена Cg3 (p = 0,008). В данном сорте уровень экспрессии Cg3 в 1,8 раза превышает показатели других сортов. Для Н.С. Катя наблюдалось аналогичное повышение экспрессии Cg3 в 2,2 раза (p = 0,012).

На основании суммарной экспрессии генов рассчитано процентное соотношение двух классов запасных белков для каждого сорта (рис. 3).

Сорта Мю 5 и Кассиди характеризуются максимальным содержанием глицининов, 86 и 82 % соответственно. Сорт Н.С. Катя демонстрирует наибольшее содержание β-конглицининов (67 %), тогда как сорт ЕСГ 1813 занимает промежуточное положение с незначительным преобладанием β-конглицининов (53 %).

Единичные пики плавления для всех исследуемых генов подтверждают высокую специфичность разработанных праймеров и корректность подобранного температурного режима. Отсутствие экспрессии гена Gy7 у всех шести сортов согласуется с данными о его крайне низкой экспрессионной активности и предрасположенности к утрате в процессе селекции [16]. Это позволяет предположить, что в исследованных сортах данный ген либо полностью утрачен, либо находится в состоянии устойчивой супрессии, закрепленной в ходе длительных селекционных программ, ориентированных на иные хозяйственно ценные признаки.

Выявленная сходная экспрессия Gy1, Gy2 и Gy3 у большинства сортов имеет четкое молекулярно-генетическое обоснование. Тандемное расположение Gy1 и Gy2 на одном локусе и их общий регуляторный контроль объясняют синхронный характер экспрессии, наблюдаемый в нашем эксперименте. Крайне низкий уровень экспрессии Gy3 относительно других генов группы I подтверждает его статус эволюционно консервативного признака, не зависящего от сортовой принадлежности и условий выращивания [17].

Исключение, представляющее наибольший интерес для селекции, составили два сорта. Канадский сорт Кассиди демонстрирует достоверно повышенную экспрессию гена Gy4, кодирующего субъединицу A5A4B3 глицинина. Ранее в [18] описывались аллельные варианты Gy4, приводящие к полному отсутствию субъединицы, однако в нашем случае мы наблюдаем противоположную ситуацию — значительное усиление экспрессии. Важно отметить, что локус Gy4 ассоциирован не только с содержанием 11S фракции, но и с уровнем 7S глобулинов, что указывает на его вовлеченность в сложные регуляторные взаимодействия, контролирующие общий белковый пул семян. Высокая экспрессия Gy4 у сорта Кассиди может быть обусловлена специфическими полиморфизмами в промоторной области, по аналогии с ранее описанными регуляторными вариантами гена Gy1 [19]. Однако точная идентификация конкретных причин будет требовать дополнительных исследований с использованием технологии секвенирования.

Рис. 3. Соотношение глицининов и β-конглицининов
Источник: выполнено П.Д. Тимкиным.

Fig. 3. Ratio of glycinins and β-conglycinins
Source: compiled by P.D. Timkin.

Французский сорт Мю 5 характеризуется достоверно повышенной экспрессией гена Gy5, кодирующего субъединицу A3B4. Несмотря на то, что субъединицы, кодируемые Gy4 и Gy5, способны к образованию гибридных тримеров и функционально совместимы, наши данные свидетельствуют о независимых селекционных событиях, закрепивших различные регуляторные мутации в разных генетических фонах. Сорта французской селекции (Мю 5, Ме 5, РТЖ Спида) в целом характеризуются выраженной сортовой специфичностью экспрессионных профилей, что отражает направленность европейских селекционных программ на различные целевые признаки.

Сорт РТЖ Спида и Н.С. Катя представляют собой уникальный случай сортоспецифичной активации транскрипции гена Cg3, кодирующего α’-субъединицу β-конглицинина. Это позволяет предположить закрепление определенного регуляторного аллеля, возможно, связанного с цис-элементами промотора или транс-факторами, специфичными для данного гена. Консервативность экспрессии Cg1 и Cg4 объясняется их критической ролью в раннем морфогенезе семян, тогда как Cg3 демонстрирует большую пластичность и, следовательно, подвержен селекционному давлению.

По суммарному соотношению транскриптов глицининов и β-конглицининов исследованные сорта четко разделяются на две контрастные группы. К глицининовым сортам относятся Мю 5 (86 %), Кассиди (82 %) и Ме 5 (64 %). Полученные для Мю 5 и Кассиди значения — одни из наиболее высоких среди когда‑либо опубликованных для европейских и североамериканских сортов сои. β-конглицининовую группу представляют Н.С. Катя (67 %), РТЖ Спида (63 %) и ЕСГ 1813 (53 %), последний занимает промежуточное положение и может рассматриваться как референтный образец с типичным для умеренно-белковых сортов соотношением фракций.

Высокое содержание глицининов имеет принципиальное технологическое значение, поскольку этот белок благодаря повышенному содержанию серосодержащих аминокислот определяет питательную ценность соевого протеина и является критическим параметром для гелеобразующей способности при производстве тофу и других соевых продуктов. В свою очередь, β-конглицинины, уступая глицининам по сбалансированности аминокислотного состава, обеспечивают превосходные эмульгирующие свойства, востребованные при производстве белковых изолятов и концентратов.

Выявленный нами диапазон соотношения 11S/7S (от 0,5 до 6,1 в пересчете на глицинин/β-конглицинин) существенно превышает опубликованные ранее данные для бразильских и американских сортов (1,31…2,21) [20]. Столь широкая вариабельность может быть обусловлена тремя факторами: во‑первых, уникальными генетическими особенностями исследованных европейских и канадских сортов, ранее не подвергавшихся столь детальному экспрессионному анализу; во‑вторых, различными методическими подходами; в‑третьих, специфическими условиями вегетации в Амурской области, которые могут модулировать экспрессионные профили интродуцированных сортов.

Проведение анализа в течение двух вегетационных сезонов позволило минимизировать влияние межгодовой климатической вариабельности на интерпретацию сортовых различий. Тем не менее многочисленные исследования убедительно доказали, что содержание белка и его фракционный состав подвержены значительному влиянию абиотических стрессов, включая засуху, температурные аномалии и засоление. Один и тот же сорт, выращенный в разных географических локациях, может демонстрировать различные соотношения глицинина и β-конглицинина [21]. В этой связи полученные нами данные следует рассматривать как характеристику экспрессионных профилей именно в условиях Амурской области, которые могут не полностью совпадать с потенциальными профилями этих же сортов в странах их происхождения. Это обстоятельство не снижает ценности полученных результатов, а напротив, позволяет оценить стабильность экспрессионных фенотипов при интродукции в новые агроклиматические условия [22].

Идентифицированные сорта-доноры представляют собой исключительную ценность для российских селекционных программ. Сорт Кассиди (донор высокой экспрессии Gy4) и сорт Мю 5 (донор высокой экспрессии Gy5) могут быть непосредственно использованы в скрещиваниях с российскими сортами для интрогрессии соответствующих регуляторных аллелей. Учитывая, что в современной литературе описано более 60 QTL, ассоциированных с содержанием глицинина, β-конглицинина и их соотношением, а также локализованы гены-кандидаты, становится возможным переход от традиционной селекции к маркер-опосредованной (MAS) [23].

Сорта РТЖ Спида и Н.С. Катя с уникально высокой экспрессией Cg3 представляют интерес для селекции на технологические свойства, поскольку β-конглицинин и особенно его α’-субъединица играют ключевую роль в формировании реологических характеристик соевых изолятов. Комбинация доноров высокой экспрессии различных субъединиц в одном генотипе открывает возможность создания сортов с заданным, прогнозируемым соотношением запасных белков и, следовательно, с целевыми показателями пищевой ценности и технологической пригодности.

Заключение

Исследование дифференциальной экспрессии генов глицининов и β-конглицининов у европейских и канадских сортов сои позволило установить, что разработанные праймеры обладают высокой специфичностью, подтвержденной единичными пиками плавления, а отсутствие экспрессии гена Gy7 у всех изученных сортов согласуется с данными о его низкой экспрессионной активности и предрасположенности к утрате в процессе селекции. Выявлено, что большинство сортов (ЕСГ 1813, РТЖ Спида, Н.С. Катя, Ме 5) характеризуются сходными, эволюционно консервативными профилями экспрессии генов Gy1, Gy2 и Gy3, при этом низкий уровень экспрессии Gy3 является стабильным сортонезависимым признаком.

Идентифицированы сорта с уникальными селекционно-ценными экспрессионными фенотипами: сорт Кассиди (Канада) демонстрирует достоверно повышенную экспрессию гена Gy4, сорт Мю 5 (Франция) — гена Gy5, сорт РТЖ Спида (Франция) — гена Cg3. По соотношению суммарной экспрессии генов запасных белков сорта четко разделены на глицининовые (Мю 5 — 86, Кассиди — 82 и Ме 5 — 64 %) и β-конглицининовые (Н.С. Катя — 67, РТЖ Спида — 63, ЕСГ 1813 — 53 %). Выявленный диапазон соотношения 11S/7S (0,5…6,1) существенно превышает опубликованные ранее данные для американских и бразильских сортов, что свидетельствует о значительном генетическом потенциале исследованных европейских и канадских генотипов.

Двухлетний период исследований подтвердил стабильность и воспроизводимость экспрессионных профилей в условиях Амурской области. Идентифицированные сорта-доноры (Кассиди — Gy4, Мю 5 — Gy5, РТЖ Спида — Cg3) рекомендованы для использования в российских селекционных программах в качестве источников ценных регуляторных аллелей. Применение маркер-опосредованной селекции с учетом эпистатических взаимодействий позволит создавать новые сорта сои с заданным соотношением запасных белков, повышенной пищевой ценностью и улучшенными технологическими свойствами, адаптированные к агроклиматическим условиям Российской Федерации.